TTC染色指数配合Logistic方程鉴定山葡萄种质抗寒性

赵 滢，艾 军，杨义明，王振兴，刘迎雪，何 伟，刘海双

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

0 引 言

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）属多年生木质藤本，是葡萄属中最抗寒的一个种[1-2]。休眠期枝条的抗寒性具有较高的遗传力，是葡萄抗寒育种的重要亲本材料[3-4]。但田间观察发现不同山葡萄种质抗寒能力存在差异，而目前适于山葡萄休眠期枝条抗寒性的鉴定方法尚不够完善，对不同山葡萄种质资源抗寒差异的了解仍不清晰[5]，影响了抗寒种质的进一步发掘与利用。

低温半致死温度（LT50）可用来反映植物的抗寒性，实验室常用相对电导率法拟合计算低温半致死温度来鉴定葡萄属的抗寒性[6-7]。然而，在实际测定中发现由于温度、浸泡时间以及空气中 CO2的溶解等因素都会对实际测定的电导值产生影响，造成测定结果重复性较差[8-10]。而采用隶属函数法对作物抗寒性进行综合评价的结果较为全面、准确[11-14]，但对于大量种质抗寒性的筛选则需要寻找更为简便且准确的鉴定方法。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法也可用于作物抗寒性鉴定[15-18]，具有直观且操作简便等优点，但目前关于TTC染色法测定枝条组织活力的研究报道中，均是通过观察枝条横截面剪口着色深浅程度进行判定[19]。在实际操作中发现该方法存在一些不足，主要是染色生成红色的三苯基甲臢（TTF）经常在失去组织活性的枝条横截面剪口外侧堆积，造成观测误差；另外，枝条横切面着色深浅程度目测也难以准确判断，需量化。

本研究将以40份山葡萄种质1 a生休眠期枝条为试材，对浸染枝段进行纵切，以枝段纵切面染色面积为判断标准，可避开原有TTC染色法横截面上出现TTF堆积问题；同时探索TTC染色图像的可视化评估，以及量化获得的染色指数能否配合 Logistic方程在山葡萄抗寒性鉴定上进行应用，并与隶属函数法获得的综合抗寒性评价结果及田间鉴定结果进行比较，以此来验证这种以枝段纵切面染色面积为判定标准的抗寒性鉴定新方法的可行性和准确性，以期建立起适于大量山葡萄种质休眠期抗寒性鉴定的简便、可靠方法，从而判断不同山葡萄种质抗寒性强弱，最终为山葡萄抗寒评价研究及抗寒育种材料选择提供有效鉴定方法和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料采自国家果树种质左家山葡萄圃，种质圃地处吉林省吉林市左家镇，位于北纬 44°04′，东经 126°05′，海拔190 m。年均气温3.6 ℃，绝对低温-39.8 ℃。圃地为南向缓坡地，土壤为暗棕森林土。圃中每份资源为扦插繁殖的自根苗，篱架生长，株行距1.0 m × 2.5 m，柱间距6 m。树体肥水管理采用常规管理模式[20]。40份试材包括纯种山葡萄种质（V. amurensis）38份，山欧杂种（（V.amurensis×V.vinifera）×V.amurensis）2 份。38 份山葡萄种质的休眠期枝条于2017年1月剪取，当年1月最低气温为-28.2 ℃；山欧杂种‘北冰红’和‘左优红’为对照品种，其休眠枝条于深秋10月底未埋土防寒前剪取，然后放入冷库中待处理。所用枝条均为长势和粗度相对一致（约0.8 cm粗）且健康成熟的1年生枝条，架面南侧1.0～1.8 m范围内取样。每份种质取50根枝条，每根60 cm长。

1.2 材料处理

材料处理参照 Zhang等的方法[21]，略有修改。将采集的枝条带回实验室，剪成20 cm长的小段，装于自封袋中，-15 ℃冰箱中贮藏。使用高低温交变试验箱（型号：GDJW-225，北京雅士林试验设备有限公司）对枝条进行低温处理，处理温度为-20、-25、-30、-35、-40、-45、-50 ℃，按4.0 ℃/h的速度降温，至设定温度后保持12 h，再按4.0 ℃/h的速度升至20 ℃后，取出静置2 h。去除表皮，避开芽眼，以备用于抗寒性评价及指标测定等研究。

1.3 抗寒性的实验室鉴定

1.3.1 TTC染色图像可视化评估鉴定枝条抗寒性

不同低温处理后，从各枝条上剪取0.5 cm小段，每份种质取10段，放入10 mL 0.5 % TTC染液中，于30 ℃恒温培养箱中避光染色4 d后取出，然后将枝段纵切，蒸馏水冲洗 3次，滤纸吸干水分，放入连有 WinRHIZOTM图像分析软件的 LA2400扫描仪中对枝段纵切面进行扫描；利用图像分析软件计算纵切面染色面积并确定染色等级；同时根据染色等级计算染色指数，以染色指数反映各试材的受冻程度。

染色分级标准如下（图1）：4级，纵切面90 %以上的面积呈红色；3级，纵切面70%～90%的面积呈红色；2级，纵切面40%～70%的面积呈红色；1级，纵切面5%～40%的面积呈红色；0级，纵切面5%以下的面积呈红色。染色指数= Σ（染色级别×枝段数）/（4×枝段总数）。

图1 染色分级标准Fig.1 Standard of staining identification

根据不同山葡萄种质各低温处理下枝段染色指数的变化情况，配合 Logistic方程建立回归方程，拟合温度拐点来确定其低温半致死温度（LT50），具体参照解越等方法[22]。

1.3.2 隶属函数法综合评价枝条抗寒性

采用隶属函数法对山葡萄种质抗寒性进行综合评价。根据最适冷冻温度下枝条 7项抗寒指标（包括相对电导率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、萌枝率、冻害指数）的平均隶属度值将山葡萄种质抗寒性分为5个级别，分级标准参照张剑侠等的方法[5]，Ⅴ级，平均隶属度值＞ 0.70～1.00；Ⅳ级＞ 0.60～0.70；Ⅲ级＞0.40～0.60；Ⅱ级＞ 0.30～0.40；Ⅰ级 0～0.30。

1） 生理指标测定

相对电导率测定参照 Verslues等[23]的方法。丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法[24]；脯氨酸含量测定采用茚三酮比色法[25]；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[26]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[27]。

2） 水培萌枝率调查

每份试材选取带芽眼的枝段共30根，10根为1次重复，共 3次重复。经-35 ℃最适冷冻温度处理（处理方法同1.2）后插入水中，1个月后调查水培萌枝率，参照Nanami等[28]方法。培养期间每 5 d换一次水。萌枝率=萌芽枝数/总枝数×100 %。

3） 冻害指数调查

枝段经最适冷冻温度处理后，观察横切面组织在低温处理后的褐变情况来确定冻害级别，冻害级别及冷害指数计算参照吕中伟等的方法[29]。

1.4 抗寒性的田间鉴定

通过调查每份试材的田间萌芽率来对其田间抗寒性进行鉴定。田间萌芽率调查参照刘崇怀等[30]方法，本试验于2017年5月初调查每份试材在资源圃中经自然越冬后的萌芽情况，统计萌芽率。萌芽率=单株芽眼萌芽数/单株总芽眼数×100%。

1.5 数据统计分析

采用SAS9.0软件对数据进行方程及相关性分析，利用 Duncan多重比较进行检验；作图采用 Sigmaplot10.0软件。

2 结果与分析

2.1 TTC染色图像可视化评估鉴定山葡萄种质抗寒性

山葡萄经不同低温处理后染色指数与冷冻温度呈典型的倒‘S’型曲线，说明可以利用非线性回归分析结合Logistic方程拟合温度拐点，确定低温半致死温度（LT50）；低温半致死温度越低，抗寒性越强[31]，‘双优’和‘北冰红’低温半致死温度分别为-38.63和-29.75 ℃（表1），可见 2个品种抗寒性差异明显；图像可视化评估所求得的染色指数也能将‘双优’和‘北冰红’的抗寒性有效分开（图2a）；同时不同低温处理下枝条的水培萌芽情况与2个品种抗寒能力相符（图2b；表2）。说明TTC染色图像可视化评估配合 Logistic方程鉴定山葡萄种质抗寒性具有一定的可行性，40份山葡萄种质抗寒性鉴定结果详见表1。

表1 40份山葡萄种质抗寒性鉴定结果Table 1 Identification of cold resistance in 40 V. amurensis germplasms

表2 低温处理下2个山葡萄品种枝条水培萌枝率Table 2 Shoots sprout rate of in two varieties of V. amurensis in hydroponic culture under cold temperatures %

通过对表1中同一温度下40份山葡萄种质的染色指数与其低温半致死温度的相关性分析表明，-20、-25、-30、-35和-40 ℃处理下的枝段染色指数与其低温半致死温度之间均呈极显著（P＜0.000 1）负相关，其中-20 ℃下，相关系数r=-0.632 55，P＜0.000 1；-25 ℃下，r=-0.791 16，P＜0.000 1；-30 ℃下，r=-0.832 20，P＜0.000 1；-35 ℃下，r=-0.861 38，P＜0.000 1；-40 ℃下，r=-0.726 03，P＜0.000 1。可见两者在-35 ℃下的相关性最强，因此本研究将-35 ℃作为最适冷冻温度，进一步利用隶属函数法对最适冷冻温度下40山葡萄种质枝条的抗寒性进行综合评价。

图2 染色指数及水培萌枝率在冷冻温度下的变化Fig.2 Change of staining index and hydroponic culture sprout rate under cold temperatures

2.2 隶属函数法综合评价山葡萄种质的抗寒性

枝条经-35 ℃最适冷冻温度处理后，对40份山葡萄种质抗寒指标进行相关性分析结果表明，指标变量间存在一定的相关性（表 3），说明多个指标提供的抗寒信息有交叉重叠现象，进一步利用主成分分析对所测指标进行综合评价。

表3 最适冷冻温度下山葡萄种质抗寒性指标的相关性分析Table 3 Correlation analysis of cold resistance indexes in V.amurensis germplasms under optimum freezing temperature

以累计贡献率大于85%为原则选择主成分，其中第1主成分中特征向量绝对值较大的是相对电导率、丙二醛及可溶性蛋白含量，贡献率达41.48%；第2主成分则是萌枝率和冻害指数，贡献率达25.70%；第3主成分中可溶性糖含量特征向量绝对值较大，贡献率为15.53%；第4主成分的游离脯氨酸含量特征向量绝对值较大，贡献率为10.90%。4个独立主成分的累计贡献率为93.61%（表4），利用隶属函数法对以上指标进行综合分析，以评价山葡萄种质的综合抗寒性。

表4 抗寒指标主成分分析Table 4 Principal components analysis for cold resistance indexes

依据平均隶属度值将40份山葡萄种质抗寒性分为5个级别，从Ⅴ级到Ⅰ级抗寒性依次降低。其中Ⅴ级抗寒种质1份；Ⅳ级抗寒种质10份；Ⅲ级抗寒种质24份；Ⅱ级抗寒种质3份；Ⅰ级抗寒2份为山欧杂种（表5）。结果表明，40份山葡萄种质抗寒性存在明显差异。整体来看，纯种山葡萄抗寒性 ＞ 山欧杂种（对照）。

表5 隶属函数法综合评价山葡萄种质抗寒性Table 5 Comprehensive analysis of cold resistances in V. amurensis germplasms

2.3 田间萌芽率

本试验连续3 a对40份山葡萄种质自然越冬后枝条的萌芽情况进行了调查，发现同一资源各年份间的田间萌芽率无明显差异。但由于田间抗寒性鉴定数据的年份要与实验室抗寒性鉴定数据的年份相对应，所以本试验田间萌芽率为2017年的调查结果（表6）。图3为2017年1—5月的气象数据，最低气温出现在1月下旬，最低为-28.2 ℃。经自然越冬后，40份山葡萄种质因抗寒性存在差异，其田间萌芽率也表现出不同（表6）。

2.4 相关性分析

利用SAS相关性分析结果表明，TTC染色图像可视化评估量化获得的染色指数配合Logistic方程求得的40份山葡萄种质低温半致死温度与其抗寒平均隶属度、田间萌芽率均呈极显著负相关（P＜0.000 1），相关系数分别为－0.883 03（图4a）和－0.876 70（图4b），说明该方法与隶属函数法对山葡萄种质抗寒性鉴定结果较为一致；且染色指数拟合计算出的低温半致死温度与实际田间萌芽率的线性关系为 y=－5.576 5x–127.36，为验证模型准确性，另从源圃中随机选取了15份山葡萄种质，利用该线性关系方程计算出了 15份种质田间萌芽率的理论值（表7），与田间萌芽率的实际值相关性为－0.985 84，说明TTC染色图像可视化评估配合Logistic方程求得的山葡萄种质低温半致死温度能够反映其在田间的实际抗寒性，且建模模型准确。

表6 山葡萄种质田间萌芽率调查结果Table 6 Investigation on germination rate of V. amurensis germplasms in field

图3 2017年气象数据Fig.3 Meteorological data in 2017

图4 抗寒性鉴定结果的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of results in cold resistances identification

表7 抗寒性数据模型验证Table 7 Proof of cold resistance data model

3 结 论

1）TTC染色枝段图像的可视化评估实现了染色面积的准确量化，量化得出的染色指数与冷冻温度呈典型的倒‘S’型曲线，说明可以利用非线性回归分析结合Logistic 方程拟合温度拐点，确定低温半致死温度。

2）该方法量化得出的染色指数配合Logistic方程确定的40份山葡萄种质低温半致死温度与其抗寒性综合评价的平均隶属度值及田间萌芽率值均呈极显著负相关（P＜0.000 1），相关系数分别为-0.883 03和-0.876 70。

3）染色指数拟合计算出的低温半致死温度与实际田间萌芽率的线性关系为y= - 5.576 5 x-127.36。利用该线性关系方程计算了建模数据以外随机选取的山葡萄种质田间萌芽率的理论值，与田间萌芽率的实际值相关性为-0.985 84，说明TTC染色图像可视化评估配合Logistic方程求得的山葡萄种质低温半致死温度能够反映其在田间的实际抗寒性。

4）40份山葡萄种质低温半致死温度在-39.41～-29.75 ℃范围内，种质抗寒性存在明显差异；总体而言，该研究的纯种山葡萄低温半致死温度的平均值为-37.25 ℃，山欧杂种山葡萄低温半致死温度的平均值为-29.81 ℃，可见纯种山葡萄的抗寒性强于山欧杂种山葡萄。

[1] 贺普超， 晁无疾. 我国葡萄属野生种质资源的抗寒性分析[J]. 园艺学报，1982，9(3)：17－21.He Puchao，Chao Wuji. Studies on the cold hardiness of eight species of vitis L.growing wild in China[J]. Acta Horticulturae Sinica, 1982, 9(3): 17－21. (in Chinese with English abstract)

[2] 沈育杰，史贵文，徐浩，等. 我国山葡萄种质资源研究与利用[J]. 特产研究，1992(3)：29－32.Shen Yujie, Shi Guiwen, Xu Hao, et al. Research and utilization of Vitis amurensis germplasm resources in China[J]. Special Wild Economic Animal and Plant Research,1992(3): 29－32. (in Chinese with English abstract)

[3] Welling A, Moritz T, Palvae T, et al. Independent activation of cold acclimation by low temperature and short photoperiod in hybrid aspen[J]. Plant Physiology, 2002, 129(4): 1633－1641.

[4] Junttila O, Kaurin L. Environmental control of cold acclimation in Salix pentandra[J]. Scandinavian Journal of Forest Research, 2008, 5(1): 195－204.

[5] 张剑侠，吴行昶，杨亚州. 葡萄种间杂种的抗寒性评价[J].北方园艺，2014(13)：1－6.Zhang Jianxia, Wu Xingchang, Yang Yazhou. Cold-resistance evaluation in grape interspecific hybrids[J]. Northern Horticulture, 2014(13): 1－6. (in Chinese with English abstract)

[6] Deans J D, Billington F J, Harvey F J. Assessment of frost damage to leafless stem tissues of Quercus petraea: A reappraisal of the method of relative conductivity[J]. Forestry,1995, 68: 25－34.

[7] 张倩，刘崇怀，郭大龙，等. 5个葡萄种群的低温半致死温度与其抗寒适应性的关系[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版)，2013，41(5)：149－154.Zhang Qian, Liu Chonghuai, Guo Dalong, et al. Relationship between LT50 and cold adaptability of five grape varieties[J].Journal of Northwest A & F University (Nat. Sci. Ed.), 2013,41(5): 149－154. (in Chinese with English abstract)

[8] Zhang M I N, Willison J H M. An improved conductivity method for the measurement of frost hardiness[J]. Canadian Journal of Botany, 1987, 65: 710－715.

[9] Stergios B G, Howell G S. Evaluation of viability tests for cold stressed plants[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science, 1973, 98(4): 325－330.

[10] 安徽农业大学. 一种茶树抗寒性早期鉴定方法：201110045014.1[P]. 2012-08-29.

[11] 张文娥，王飞，潘学军. 应用隶属函数法综合评价葡萄种间抗寒性[J]. 果树学报，2007，24(6)：849－853.Zhang Wene, Wang Fei, Pan Yiingjun. Comprehensive evaluation on cold hardiness of Vitis species by subordinate function[J]. Journal of Fruit Science, 2007, 24(6): 849－853.(in Chinese with English abstract)

[12] 刘杜玲，张博勇，孙红梅，等. 早实核桃不同品种抗寒性综合评价[J]. 园艺学报，2015，42(3)：545－553.Liu Duling, Zhang Boyong, Sun Hongmei, et al. Comprehensive evaluation on drought resistance of early fruiting walnut cultivars[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2015, 42(3): 545－553. (in Chinese with English abstract)

[13] 令凡，焦健，李朝周，等. 不同油橄榄品种对低温胁迫的生理响应及抗寒性综合评价[J]. 西北植物学报，2015，35(3)：508－515.Ling Fan, Jiao Jian, Li Chaozhou, et al. Physiological response and comprehensive evaluation of cold resistance under cold stress for different varieties of Olea europaea[J].Acta. Bot. Boreal-Occident Sin, 2015, 35(3): 508－515. (in Chinese with English abstract)

[14] 刘海卿，孙万仓，刘自刚，等. 北方寒旱区白菜型冬油菜抗寒性与抗旱性评价及其关系[J]. 中国农业科学，2015，48(18)：3743－3756.Liu Haiqing, Sun Wancang, Liu Zigang, et al. Evaluation of drought resistance and cold resistance and research of their relationship at seedling stage of winter rapeseed (Brassica campestris L.) in cold and arid regions in North China[J].Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(18): 3743－3756. (in Chinese with English abstract)

[15] 张海晶，张金梅，辛霞，等. 马铃薯茎尖超低温保存流程TTC活力响应[J]. 植物遗传资源学报，2015，16(3)：555－560.Zhang Haijing, Zhang Jinmei, Xin Xia, et al. Study on potato shoot tips vitality responses during cryopreservation by TTC staining method[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2015,16 (3) :555－560. (in Chinese with English abstract)

[16] 张启翔. 梅花及其杂交种根系抗寒性研究初报[J]. 北京林业大学学报，1992，14(增刊4)：83－86.Zhang Qixiang. A preliminary study on cold resistance of root system of Mei and its hybrid cultivars[J]. Journal of Beijing Forestry University, 1992, 14 (Supp.4): 83－86. (in Chinese with English abstract)

[17] Thomas F M, Ahlers U. Effects of excess nitrogen on frost hardiness and freezing injury of above-ground tissue in you6ng oaks (Quercus petraea and robur)[J]. New phytologist,2010, 144(1): 73－83

[18] 董丽，黄亦工，贾麦娥，等. 北京园林主要常绿阔叶植物抗冻性及其测定方法[J]. 北京林业大学学报，2002，24(3)：70－73.Dong Li, Huang Yigong, Jia Maie, et al. Freezing tolerance and methods of evaluation of introduced evergreen broad-leaf plants in open gardens in Beijing of China[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2002, 24 (3): 70－73. (in Chinese with English abstract)

[19] 田景花，王红霞，高仪，等. 核桃属植物休眠期的抗寒性鉴定[J]. 园艺学报，2013，40(6)：1051－1060.Tian Jinghua, Wang Hongxia, Gao Yi, et al. Assessment of freezing tolerance of Juglans Germplasms by using annual dormant branches[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2013, 40 (6):1051－1060. (in Chinese with English abstract)

[20] 艾军，沈育杰. 山葡萄规范化栽培与酿酒技术[M]. 北京：中国农业出版社，2017.

[21] Zhang J，Wu X，Niu R，et al. Cold-resistance evaluation in 25 wild grape species[J]. Vitis, 2012, 51(4):153－160.

[22] 解越，张敏，梁飞侠，等. 电导法配合Logistic方程鉴定西葫芦和黄瓜果实抗寒性[J]. 农业工程学报，2015，31(7)：292－295.Xie Yue，Zhang Min，Liang Feixia, et al. Identification of cold resistance of squash and cucumber fruits by electrical conductivity and Logistic equation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2015, 31(7): 292－295. (in Chinese with English abstract)

[23] Verslues P E, Agarwal M, Katiyar-Agarwal S, et al. Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stress that affect plant water status[J]. Plant Journal, 2006, 45(4): 523－539.

[24] Yang S H, Wang J, Li S H, et al. The effects of UV-B radiation on photosynthesis in relation to Photosystem II photochemistry, thermal dissipation and antioxidant defenses in winter wheat (Triticum aestivum L.) seedlings at different growth temperatures[J]. Functional Plant Biology, 2007,34(10): 907－917.

[25] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[26] 高俊凤. 植物生理学实验指导[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[27] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry,1976, 72, 248－254.

[28] Nanami S, Kawaguchi H, Tateno R, et al. Sprouting traits and population structure of co-occurring Castanopsis species in an evergreen broad- leaved forest in southern China[J].Ecological Research, 2004, 19(3): 341－348.

[29] 吕中伟，王鹏，许领军，等. 河南省葡萄冻害调查及应对措施[J]. 山西果树，2011(1)：37－38.Lu Zhongwei, Wang Peng, Xu Lingjun, et al. Investigation and countermeasures of grape freeze injury in Henan[J].Shanxi Fruits, 2011(1): 37－38. (in Chinese with English abstract)

[30] 刘崇怀，沈育杰，陈俊. 葡萄种质资源描述规范和数据标准[M]. 北京: 中国农业出版社，2006.

[31] 于立洋，李政，韩佩尧，等. 8个新疆野苹果优良无性系抗寒性比较[J]. 核农学报，2017，31(9)：1827－1835.Yu Liyang, Li Zheng, Han Peiyao, et al. Comparison of cold hardiness of 8 Malus sieversii Clones[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2017, 31(9):1827－1835. (in Chinese with English abstract)