超高效液相串联质谱法检测β兴奋剂类快速前处理方法研究

徐春奎 李 艳 陈梦静 吕晓峰

（盐城市农产品质量监督检验测试中心，江苏 盐城 224002）

近几年，随着农产品质量安全事件频发，令人们神经紧绷，农产品质量安全问题已成为社会高度关注的四大问题之一。β-兴奋剂类药物俗称“瘦肉精”，常用的包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等十几种物质，目前，此类药物的主要作用是促进动物蛋白质的合成，加速脂肪的转化和分解，提高瘦肉率；且在食用组织中以肝、肾、肌肉中沉积较高，一旦被人摄入以后，会产生心跳过快、四肢肌肉颤动、头晕乏力等神经中枢中毒症状，严重可导致死亡，对人类健康构成了极大地威胁，因此，我国农业部先后多次发文禁止β-兴奋剂类在畜牧生产中使用。

目前国内外已有很多关于动物源性食品中兽药残留检测的分析研究，检测兽药残留仪器主要是速测仪、色谱仪、色谱质谱联用仪。能够比较准确定性定量检测仪器主要是色谱仪和色谱质谱联用仪。在前处理技术方面，与蔬菜中农药残留分析相比，由于肌肉组织基质比较复杂，相对快速简单地前处理方法在兽药残留检测中应用很有限。笔者长期从事农畜产品检测工作，本文从2种前处理方法比较来探索液质法检测β-兴奋剂类在猪肝和牛肉基质中快速检测前处理技术研究，为探索兽药残留检测QuEChERS法建立奠定基础。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

仪器耗材：Agilent 1290 液相色谱仪，Agilent 6460C三重四极杆质谱仪（配电喷雾离子源）；高速分散器（IKA），离心机（赛默飞），超声仪（宁波新芝），旋涡混合器（IKA）；固相萃取装置（天津恒奥，HHE-12B），氮吹仪（北京同泰联，TTL-DCII），天平（艾德姆，HCB602H），瓶口分液器（德国普兰德），真空泵（天津恒奥），0.22μm微孔滤膜，固相萃取小柱（500mg/6cc，Waters）。

药品试剂：7种兽药为莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、氯丙那林、妥布特罗、特布他林，对应的同位素内标为莱克多巴胺-D6、克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3、西马特罗-D7、氯丙那林-D7、妥布特罗-D9、特布他林-D9，均为德国Dr.公司，标准品纯度均不低于99%；乙腈、甲醇、正己烷、异丙醇为色谱纯（天地），甲酸、乙酸铵、氨水为优级纯，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（Anpel）。

标准溶液配制：分别精密称取适量的7种兽药莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、氯丙那林、妥布特罗、特布他林标品，用甲醇分别溶解配制成浓度为1000μg/mL的各药物标准储备液；准确吸取100μL的各药物标准储备液用甲醇稀释定容至10mL，配制成浓度为10μg/mL的混标储备液，再准确吸取100μL的各药物标准储备液用甲醇稀释定容至10mL，配制成浓度为0.1μg/mL的混标工作液。7种同位素内标莱克多巴胺-D6、克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3、西马特罗-D7、氯丙那林-D7、妥布特罗-D9、特布他林-D9的混合同位素内标溶液配制同上。

1.2 试验设计

本试验通过加标回收验证检验检测方法，思路为设3个浓度梯度，从低到高分别为0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg，每个浓度设3个平行样，另设空白样品同时比对。标准曲线配制：标准曲线浓度6个点分别为0.625μg/kg，1.25μg/kg，2.5μg/kg，5μg/kg，10μg/kg、20g/kg。

1.3 样品前处理过程

方法1（内标法）：准确称取2.00g（±0.02g）均匀猪肝（或牛肉）试样，加入适量内标，再加入6.00mL乙腈-异丙醇混合溶液（4∶1，v/v），涡旋混匀后，振荡10min，10000r/min离心5min，取全部上清液于55℃下氮吹至近干。加入0.2mol/L乙酸铵缓冲液（pH=5.2）2mL，充分溶解，再加入40μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，55℃条件下避光水浴振荡2h左右。取出后至室温，加甲醇4mL，涡旋混匀，肌肉组织8000r/min离心5min，上清液备用；肝脏组织8000r/min离心5min，上清液转移至新的离心管，加3mL正己烷，涡旋后，8000r/min离心5min，取全部下清待净化备用；固相萃取小柱依次用甲醇、2%甲酸溶液各5mL活化，取全部备用液过柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各5mL淋洗抽干，最后用5%氨水甲醇溶液5mL洗脱；洗脱液于50℃下氮吹干，用0.5mL甲醇-0.1%甲酸溶液（1∶9，v/v）复溶，涡旋混匀，过0.22μm有机系微孔滤膜，供上机待测。

方法2（内标法）：准确称取2.00g（±0.02g）均匀猪肝（或牛肉）试样，加入适量内标，再加入6.00mL80%乙腈水（含0.3%乙酸），涡旋30s，中速水平振荡10min，超声提取5min，8000r/min离心5min，取全部上清液待净化，以下净化过程同方法1。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent C18 柱 （Rapid Resolution HD 2.1×10 0mm，1.8-Micron）；流 动 相：A相为0.1% （v/v，下同）甲酸水（含5mm的乙酸铵），B相为0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱程序：0～4.0min，从80%A变为60%A，4.0～4.5min，从 60%A 变为 10%A，4.5～6.0min，保 持 10%A；6.0～6.10min从 10%A 变 为 80%A，6.10～10.00min，保持80%A；流速：0.4ml/min；进样量：1.0μL；时间：10min；柱温：30 ℃ 。

1.5 质谱条件

电离模式：电喷雾正离子（ESI+）；毛细管电压：40kV；离子源温度：350℃；干燥气流速：11L/ min，雾化器压力：45psi；采集方式：多反应监测扫描模式（MRM）；增加电压（+）：200V。质谱采集参数见表1。

表1 7种β-兴奋剂及同位素内标的保留时间、定量离子对、定性离子对、锥孔电压和碰撞能量

表2 猪肝基质7种β-兴奋剂的加标回收情况

表3 牛肉基质7种β-兴奋剂的加标回收情况

2 结果与分析

2.1 方法1前处理结果

前处理方法1为江苏省畜产品例行监测计划推荐的方法之一。从表2可以看出，方法1在猪肝中添加7种β-兴奋剂类药物，在低浓度（0.5μg/kg）时加标回收率在84.63%～118.59%，RSD在6.71%～12.75%；在中等浓度水平时（1μg/kg）加标回收率在78.56%～112.17%，RSD在1.70%～10.15%；在高浓度水平时（2μg/kg）加标回收率在76.32%～106.80%，RSD在1.57%～8.26%。从表3可以看出，方法1在牛肉中加标回收情况，在低浓度（0.5μg/kg）时加标回收率在100.03%～119.05%，RSD在7.58%～14.15%；在中等浓度水平时（1μg/kg）加标回收率在80.49%～102.77%，RSD在2.18%～8.35%；在高浓度水平时（2μg/kg）加标回收率在81.92%～105.33%，RSD在2.14%～11.53%。

2.2 方法2前处理结果

前处理方法2为笔者实验室探索方法。从表2可以看出，方法2在猪肝中添加7种β-兴奋剂类药物，在低浓度（0.5μg/kg）时加标回收率在87.64%～117.00%，RSD在3.48%～12.73%；在中等浓度水平时（1μg/kg）加标回收率在80.23%～96.89%，RSD在1.82%～9.83%；在高浓度水平时（2μg/kg）加标回收率在91.58%～109.25%，RSD在2.37%～12.12%。从表3可以看出，方法2在牛肉中加标回收情况，在低浓度（0.5μg/kg）时加标回收率在98.54%～116.63%，RSD在7.88%～12.22%；在中等浓度水平时（1μg/kg）加标回收率在96.07%～108.25%，RSD在0.85%～7.31%；在高浓度水平时（2μg/kg）加标回收率在91.14%～109.52%，RSD在3.15%～11.26%。

2.3 实际样品检测

用本试验的2种方法同时测定2016年第4季度江苏省畜产品例行监测任务中30份猪肝样品和10份牛肉样品。实验结果表明，2种方法测定的样品中7种β-兴奋剂均为阴性。同时各做1份猪肝和牛肉加标为阳性样品，2种前处理方法结果均在2.00μg/kg左右，均判断为阳性。

3 讨论

QuEChERS法自2003年由Anastassiades等提出以来，广泛的应用于农兽药残留检测分析，但是在动物源性食品检测中应用较少。QuEChERS法步骤相对简单，也比较深得检测人员的青睐。根据江苏省畜产品例行监测β-兴奋剂类判定值为 1μg/kg，笔者从 0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg 3个浓度梯度设计试验，采用在空白猪肝和牛肉样品中添加药物计算回收率来评价前处理效果，由表2和表3可以看出，检测β-兴奋剂类残留的2种前处理方法的回收率均比较稳定，在76.32%～119.05%的范围内，且RSD均在15%之内，且7种药物标准曲线在0.625%～20μg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，均符合检测技术方法要求。但是方法1前处理一个样品需要花费时间在4h左右，主要是因为酶解时间比较长，笔者也尝试过乙腈-异丙醇混合溶液（4∶1，v/v）提取，省略酶解步骤的前处理，但是结果不是特别理想，尤其是对莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等苯酚型结构的药物影响较大，加标回收结果不是很满意。方法2采用酸化的乙腈水经过振荡超声充分提取，用固相填料进行萃取净化，快速简洁，一般前处理一个样品需要花费1h左右，与方法1相比，大大节约了时间，达到了省时省力的效果，最重要的是，2种前处理方法加标回收结果均比较稳定，且结果比较接近，均比较满意。

4 结论

本研究以江苏省例行监测畜产品参数为依据，探索定性定量检测β-兴奋剂类兽药残留相对简单省时省力的前处理方法。与省例行监测β-兴奋剂类检测建议使用的标准或方法相比，笔者探索了一种相对简单的前处理方法，并具有同等效果的检测结果。为从事畜产品检测工作的检测人员提供了筛选方法，有助于检测机构快速准确检测兽药定性定量分析，并为日常监控提供依据。

[1]叶妮,孙雷,尹晖,等.UPLC-MS/MS法检测动物性食品中19种β-受体激动剂残留[J].中国兽药杂志,2015,49(9):51-59.

[2]农业部1025号公告-18-2008,动物源性食品中β-受体激动剂残留检测液相色谱——串联质谱法[S].中华人民共和国国家标准.