高压氧辅助抗蛇毒血清治疗对五步蛇毒中毒大鼠肾保护作用研究*

贺东坡，谢智慧，喻安永,李 沫

(遵义医学院附属医院:1.急诊科;2.高压氧科，贵州遵义 563000)

五步蛇又称尖吻蝮蛇，在我国主要分布于南方，蛇毒含血循环毒素、酶类及少量神经毒素等。被咬伤后可出现患者肢体肿胀、肾功能受损、急性化脓性感染甚至弥散性血管内凝血(DIC)危及生命。毒蛇咬伤后约1/3的毒素经肾脏排泄。因此，蛇咬伤后需注重肾功能的影响。高压氧(HBO)可使血氧含量增加、增加局部病变的供氧、通过抑制炎性介质的释放减轻炎症反应，而蛇咬伤后肾脏处于缺血、缺氧状态、炎性介质大量合成和释放、过多活性氧自由基产生，理论上通过HBO的治疗可改善肾损伤。故本实验拟在动物实验的基础上通过研究五步蛇咬伤后大鼠肾损伤的变化，以及蛇咬伤后在抗蛇毒血清治疗的同时给予HBO辅助治疗，进一步探讨HBO的辅助治疗对五步蛇中毒大鼠肾保护的作用，为HBO辅助治疗毒蛇咬伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：健康成年雄性SD大鼠96只，体质量(250.00±20.00)g，分批购自陆军军医大学西南医院实验动物中心。试剂：五步蛇蛇毒，购买自安徽黄山祁门蛇伤研究所。

1.2方法

1.2.1静脉注射五步蛇蛇毒致大鼠肾损伤模型的建立 参考相关文献[1-3]及预实验结果，使用稀释好的五步蛇蛇毒[(半数致死量)LD50=1.594 mg/kg]，在大鼠的尾部消毒后从尾静脉注射五步蛇毒，剂量为鼠0.8×LD50，以生理盐水溶解成1.594 mg/mL的浓度注射，根据体质量计算出注射剂量。如大鼠注射蛇毒后出现立毛、喜静少动、食欲食量差、体质量下降、耳郭周边有散在的出血点、血尿、大小便失禁等即可判断造模成功。在造模的过程中出现动物死亡，或未达到中毒模型标准的予以剔除，再重新补充SD大鼠，重新造模。

1.2.2动物分组 将健康成年雄性SD大鼠96只分为对照组(A组)、蛇毒中毒组(B组)、血清治疗组(C组)、血清联合HBO治疗组(D组)，每组24只。B、C、D组大鼠经尾静脉注射五步蛇蛇毒建立中毒模型，C组于建模成功后即从尾静脉注射抗蛇毒血清，D组于注射抗蛇毒血清后0、4、11、23 h将动物置于动物实验用HBO舱(型号JB150-98)内，加压5 min至0.12 MPa，同时纯氧洗舱，之后5 min加至0.2 MPa，稳压吸氧40 min，减压10 min，舱内氧浓度保持在95%以上；A组不予任何处理。

1.2.3血清肌酐(Cr)、凝血功能检测 将A、B、C、D组分别于模型建立后1、5、12、24 h分别取3只大鼠用10%水合氯醛经腹腔充分麻醉，乙醇消毒、备皮、铺巾，无菌剪自腹中线自下而上逐层打开腹腔、移开肠管、找到腹主动脉，用一次性注射器抽出5 mL血后用止血钳夹闭腹主动脉，将抽出的血3 mL注入生化管，待其凝固后在4 ℃以3 000 r/min离心15 min，取上清液400 μL送化验室检测Cr。剩余2 mL注入加有枸橼酸钠的EP管中，在4 ℃以3 000 r/min离心15 min，用于检测凝血功能，包括活化部分凝血活酶(APTT)、凝血酶原时间(PT)和纤维蛋白原(FIB)。

1.2.4病理学观察 A、B、C、D组分别于模型建立后1、5、12、24 h分别取3只大鼠先用生理盐水经左心室灌注，待灌注液清亮后，再加入多聚甲醛继续灌注从而固定肾组织，并取右肾上极实质部分行HE染色光镜下观察病理变化。

2 结 果

2.1五步蛇毒中毒模型建立成功后一般表现 中毒后大鼠表现出立毛、喜静少动、食欲食量差、体质量下降、耳郭周边有散在的出血点、血尿、大小便失禁，肉眼观察肾脏出现明显的充血情况。

2.2各组大鼠肾组织病理改变 B组大鼠出现肾小球出血、肾小囊扩张，周围毛细血管充血，肾小管扩张，可见细胞低平，刷状缘脱落，肾小管上皮细胞空泡化，肾间质组织炎性细胞浸润。随着中毒时间的延长肾出血减少，炎性细胞浸润增加。C组治疗后1 h大鼠肾小球圆形，鳗氏囊壁狭窄，肾小管上皮细胞空泡化及脱落细胞，小管周围有出血。D组治疗后1 h大鼠肾小球圆稍充血，肾小管上皮细胞空泡化及脱落细胞减轻，小管周围少量出血。B组大鼠中毒5 h后肾小球椭圆形略充血，肾小管略扩张，小管周围有出血，周围有炎性细胞浸润。C组治疗5 h后大鼠肾小球圆形周围少量充血，外表规整，肾小管周围出血减少，有少量炎性细胞浸润，肾小囊无扩张。D组治疗5 h后大鼠肾小球椭圆形周围充血减少，外表规整，肾小管周围出血减少，有炎性渗出，肾小囊无扩张，见图1。

2.3各组大鼠各时间点Cr水平比较 与A组比较，B组各时间点的血Cr水平明显升高(P<0.05)。与B组比较，C、D组在治疗1 h后血Cr水平明显降低(P<0.05)，且D组血Cr水平明显低于C组(P<0.05)，见表1

2.4各组大鼠各时间点凝血功能比较 与A组比较，B组各时间点的APTT、PT均明显升高(P<0.05)。与B组比较，C、D组APTT水平均明显降低。在注毒1、5 h后D组APTT水平又明显低于C组(P<0.05)。C、D组PT水平各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较，B组FIB于注毒后1 h明显降低(P<0.05)，予以血清、血清+HBO治疗后明显上调，但C、D组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2～4。

A：B组中毒1 h；B：C组治疗1 h；C：D组治疗1 h；D：B组中毒5 h；E：C组治疗5 h；F：D组治疗5 h

图1 B、C、D组大鼠不同时间肾脏病理学改变

表1 各组大鼠各时间点Cr水平比较

a：P<0.05,与同时点A组比较；b：P<0.05,与同时点B组比较；c：P<0.05，与同时点C组比较

表2 各组大鼠APTT水平比较

a：P<0.05,与同时点A组比较；b：P<0.05，与同时点B组比较；c：P<0.05，与同时点C组比较

表3 各组大鼠PT水平比较

a：P<0.05,与同时点A组比较；b：P<0.05，与同时点B组比较

组别1 h5 h12 h24 hA组1.70±0.301.70±0.301.70±0.301.70±0.30B组0.20±0.10a1.20±0.802.50±1.201.40±0.90C组1.50±0.60b1.70±0.502.50±1.402.10±0.80D组1.70±0.60b1.20±0.202.50±0.403.0±0.30

a：P<0.05,与同时点A组比较；b：P<0.05，与同时点B组比较

3 讨 论

五步蛇属血循环类毒蛇，蛇毒含血循毒素、酶类及少量神经毒素等[4-5]。被咬伤后可出现患者肢体肿胀、肾功能受损、急性化脓性感染甚至DIC危及生命。因肾脏是蛇毒排泄的重要途径之一，肾损伤是五步蛇咬伤常见的并发症[6-9]，因此，保护肾脏尤为重要。

经查阅相关文献，目前比较认同的毒蛇咬伤导致肾功能异常具体机制有以下几种：(1)毒蛇咬伤后肾脏出现缺血、缺氧，炎症细胞被激活、炎症介质的合成和释放[10]。蛇咬伤后有大量炎症细胞侵入后引起的肾脏病理改变[11]，PETRICEVICH等[12]通过静脉给小鼠注射蝮蛇蛇毒，在小鼠的血清中检测到血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)均有所升高。(2)蛇毒中毒后机体内生成活性氧自由基增多。(3)蛇毒对红细胞有溶解作用，其释放出的血红蛋白可引起肾小管的栓塞，从而导致肾损伤。(4)机体凝血系统被毒素破坏，导致凝血异常，引起肾出血。(5)活化磷脂酶A(PLA)，活化后的PLA形成的卵磷脂可引起血管内的溶血[13-14]， COSTA等[15]证实蛇毒中的PLA-2可升高人体血清TNF-α、IL-1。(6)类组胺的作用，蛇毒进入血液循环直接干扰类组胺的释放和循环，可导致肾血流量的减少，肾小管收缩，肾小球滤过率(GRF)下降，最终引起肾功能的损伤。(7)肾小管上皮细胞直接受损。(8)横纹肌的溶解。总之，以上各因素最终导致肾血流量减少，肾小管收缩而使肾脏缺血缺氧，从而引起肾损伤。

近年来HBO作为肾损伤的辅助治疗已成为一个热点研究，并被大家逐渐认可。其主要作用机制有以下几方面：(1)通过HBO治疗，可以增加血氧含量、提高血氧分压、使血氧弥散距离增加，从而改善病变部位的氧供；(2)改善组织微循环障碍；(3)抗氧化性损伤，HBO的治疗在一定程度上增加了机体的抗氧化能力，使受损组织氧化损伤减少；(4)抑制炎性介质的释放、减轻炎症反应；(5)加快组织损伤的自我修复。本课题组前期研究已证实，HBO可以通过减少TNF-α的生成和抗组织脂质过氧化，从而减轻肾缺血再灌注损伤(IRI)及发挥保护肾功能的作用[5]。

抗蛇毒血清在蛇咬伤中的治疗作用仍为首选治疗，也是目前对毒蛇咬伤最有效的治疗，且其治疗时间越早越好。但关于HBO辅助抗蛇毒血清治疗五步蛇咬伤的实验研究报道甚少。

通过本实验发现，经静脉注射五步蛇毒的中毒大鼠中出现血尿，肉眼观察到中毒大鼠肾脏有明显水肿、充血。肾HE染色观察，注毒后1 h的B组中可看到有肾小球的出血，肾小管上皮细胞空泡化、上皮刷状缘脱落，管腔内的出血，炎性细胞的浸润等。以上表现提示通过静脉注射五步蛇毒可造成肾脏损伤。而蛇毒中毒后的大鼠在通过抗蛇毒血清治疗(C、D组)后的1、5 h肾损伤的程度逐渐减轻，肾小球表现为圆形，外表规整，肾小管的扩张程度、空泡化及脱落细胞较B组减轻，但在注毒后12、24 h时肾出血的程度及浸润炎性细胞数量的多少改善不明显。D组各时间点肾损伤的程度较C组减轻更明显，其肾小球表现为圆形，外表规整，肾小管出血的程度及炎症浸润的面积减少，以上结果表示，HBO早期干预对五步蛇毒中毒大鼠肾损伤有保护作用。

血Cr水平可反映肾小球的滤过功能，在被五步蛇咬伤中毒后，可引起GRF的下降，因此测定Cr水平对于评估蛇伤后肾损伤的严重程度有一定指导意义。与A组比较，B、C、D组各时间点的血Cr水平明显升高(P<0.05)。与B组比较，C、D组在1 h 血Cr水平明显降低(P<0.05)，但在5 h之后差异无统计学意义(P>0.05)。提示注毒1 h后中毒大鼠的肾功能出现了异常，并在经抗蛇毒血清治疗后得到了改善，5 h之后再进行治疗效果不明显。D组血Cr水平在1 h也明显低于C组(P<0.05)，5 h之后B、C、D组Cr水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示抗蛇毒血清联合HBO治疗效果优于单纯使用抗蛇毒血清，且越早使用HBO治疗效果越好。

在凝血功能方面，B组各时间点的APTT值与A组相同时间点比较均明显延长(P<0.05)。随着时间延长APTT值虽有下降趋势，但与A组比较仍明显升高(P<0.05)。B组各时间点PT值与A组相同时间点比较均明显延长(P<0.05)，而其他各组各时间点间数值的比较差异无统计学意义(P>0.05)。B组的FIB数值在1 h明显低于A组(P<0.05)，而随时间延长，注射毒素后5 h其值逐渐变为正常；其他各组各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果提示在五步蛇毒中毒后会引起机体FIB大量破坏，进一步发生凝血系统破坏，影响血液凝固，促进出血的发生，最终导致凝血功能的异常。血清治疗后APTT值较治疗前有下降趋势(P<0.05)，虽然PT、FIB改善不明显，但仍提示抗蛇毒血清治疗有临床意义。经血清联合HBO治疗后，APTT值下降趋势较单纯血清治疗改善更明显(P<0.05)，特别是注射毒素5 h之内，这提示HBO治疗可改善凝血功能，且越早干预机体预后越佳。凝血功能变化与血Cr水平的变化同步，均为在1 h时血清联合HBO治疗效果最明显。提示监测凝血功能的变化对于判断肾功能变化有一定的意义。

综上所述，本实验在大鼠五步蛇毒中毒模型建立成功的基础上，通过肾脏病理变化的观察，检测肾功能、凝血功能指标，进一步来探讨血清联合HBO治疗效果，实验结果证实HBO辅助抗蛇毒血清治疗对五步蛇毒中毒大鼠肾损伤的恢复起到了积极的作用，治疗时间越早效果越明显。对临床中出现的肾损伤，HBO的辅助治疗有望成为一种新的治疗手段。

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