用SOS/umu试验评价降雨径流遗传毒性的变化

高晶，张肖，赵乐军，宋现才，金星龙, *

1. 天津理工大学环境科学与安全工程学院，天津 300384 2. 天津市市政工程设计研究院，天津 300392

随着人口的快速增长和城市扩张，城市水资源需求量逐年增大，水资源短缺和水污染日益严重，导致城市水资源压力加剧。近年来，海绵城市研究和建设使得降雨径流受到广泛关注，并且一些城市已将其作为灌溉和非饮用水水源[1]。但值得注意的是，降雨径流中污染物通过地表径流进入城市受纳水体，通过物理、化学和生物作用进入水生生物和底栖动物体内，通过食物链发生富集和生物放大作用，对水生生物和人类的健康构成潜在的威胁[2]。因此，在雨水收集利用中，检测雨水的污染物毒性是确保雨水安全利用的重要手段之一。

城市径流中的污染物毒性效应及其潜在的生态影响的研究尚处于起步阶段。澳大利亚现有的雨水回收指南只包含一些收集和回收的常规水质参数的数据[3]。而且，雨水的收集研究主要集中在病原体的判断上，而忽略对有毒的化学物质的判断。即使关注化学物质，大多数研究也集中在优先污染物[4]。近年来，我国也开展降雨径流毒性的研究，张莉莉等[2]对降雨径流的毒性、评价方法及评价鉴定进行了综述，但主要是针对急性毒性的方法介绍，对遗传毒性的研究较少。

SOS/umu试验利用可致DNA受损的化学物质诱导产生SOS反应并产生β-半乳糖苷酶基因与UmuC基因相融合，根据细菌生成的β-半乳糖苷酶的数量，即可判断DNA受损的程度[5]。目前SOS/umu已广泛用于测试饮用水消毒副产物、自然水[6]和污水处理厂出水[7]的遗传毒性效应。因而采用遗传毒性研究雨水径流过程中的生物毒性，对雨水的回收利用有重要的意义。本文通过SOS/umu试验对不同下垫面降雨过程中不同时间段的雨水样品进行遗传毒性测试，分析降雨过程生物毒性的变化趋势，直观评价降雨径流的生物安全性。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

试验菌种为鼠伤寒沙门式菌(Salmonellatyphimurium)TA1535/PSK1002菌株，将已灭菌的20%丙三醇溶液与菌液以1:1的体积比混合，分别装到1.5 mL的冻存离心管中，每个离心管存放1.0 mL的菌种，放置在-80 ℃冰箱中保存一年。

试验所用主要仪器：水浴振荡器(SHA-C，巩义市予华仪器有限责任公司)、微孔板恒温振荡器(HWF200，南京互川电子有限公司)、高压灭菌锅(DSX-280B，上海申安医疗器械厂)、紫外可见分光光度计(Cary50，美国瓦立安中国有限公司)等。主要试剂：二甲基亚砜(DMSO， ACS级，美国AMERSCO)，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO，分析纯，上海麦克林)，二氯甲烷、甲醇、正己烷(美国BCL， 均为HPLC级)，β-半乳糖苷酶(ONPG，分析纯，北京Solarbio)等。

1.2 样品采集与前处理

2017-05—2017-06期间共采集2场降雨，2场降雨时间均为4 h，降雨强度均为中雨。5月份降雨量为9.8 mm，屋面和道路采集的样品数分别为9和3；6月份降雨量为38.6 mm，屋面和道路采集的样品数分别为9和6。采样方法参照《大气降水样品的采集与保存》(GB13580.2—92)进行，采样瓶使用前经过5%硝酸浸泡、自来水冲洗、蒸馏水润洗，分别在屋面的落水管和道路的排水口处进行雨水样品收集。

降雨初期30 min内，每隔10 min采集一次；30～60 min内，每隔15 min采集一次；60～120 min内，每隔30 min采集一次；2 h以后每隔1 h采集一次直至降雨结束[8-10]，每次收集4 L雨水样品，立即运回实验室。分别用滤纸和玻璃纤维滤膜过滤(GF/F 47 mm，Whatman公司)，然后用OASIS HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL，Waters公司)进行富集，萃取柱事先用甲醇、稀盐酸和超纯水活化。富集结束后，萃取柱分别用10 mL甲醇和15 mL正己烷和二氯甲烷(体积比1:2)进行洗脱并在氮吹仪下吹干至0.9 mL，再用氮气流吹干，用200 μL DMSO定容，-20 ℃保存。

1.3 SOS/umu试验

从-80 ℃冰箱取出菌种，用TGA培养基复苏，37 ℃隔夜振荡培养12 h后在无菌操作台进行转接，继续培养1.5 h，然后测菌液在595 nm处时吸光度为0.7～0.8。96孔板A中按照不同浓度设置水样、阴性对照(DMSO稀释液)、阳性对照(4-NQO)和空白对照，每组3个平行样，振荡培养2 h后转移到提前加入135 μL的培养基B板，继续培养2 h。B板培养期间准备C板，每孔加入120 μL B-buffer，并配制邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)溶液，避光振摇2 h，B板结束后放入冰箱10 min用酶标仪测定OD595，然后从B板每孔吸取30 μL到C板相应位置，并立即加入30 μL ONPG溶液混合振荡30 min，结束后加入反应终止液120 μL的Na2CO3，放入冰箱10 min用酶标仪测定OD415。

1.4 数据处理与计算

SOS/umu测试结果的计算方法参见文献[11]：

(1)

(2)

式中，G为生长因子，G大于0.5的数据可用于计算IR；IR为诱导率，IR>2可判断为致突变阳性结果；A595T、A595B、A595N、A415T、A415B、A415N分别为待测样品、空白对照、阴性对照在595 nm和415 nm处的吸光度。测试标准系列浓度的阳性参照物系列后，以阳性参照物4-NQO的质量为横坐标，诱导率IR为纵坐标绘制剂量-效应曲线，得其方程为y=0.10944x+1(R2=0.9946)。相同实验条件下测试雨水样品，绘制水样的剂量-效应曲线，利用2个剂量-效应曲线线性拟合斜率的比值，将雨水样品毒性以4-NQO当量浓度表示，单位为ng·L-1。

2 结果(Results)

图1展示了5月份不同采样时间屋面降雨径流的遗传毒性变化。从图1(A)中可知，屋面降雨径流水样剂量-效应线性拟合斜率随采样时间呈降低趋势。由图1(B)可知，降雨初期30 min内雨水样品的TEQ4-NQO分别是160 ng·L-1、269 ng·L-1和267 ng·L-1，在10～20 min内达到最大，在经过降雨初期后，遗传毒性大幅度下降，30～45 min内达到189 ng·L-1。随着降雨时间的增加，降雨持续45 min时屋面的大部分污染物已经被冲刷，遗传毒性也随之逐渐降低，直至降雨结束达到21 ng·L-1。这表明雨水样品中的污染物主要来源于下垫面，其大部分污染物主要被初期雨水冲刷，导致初期雨水样品毒性较大，说明雨水样品毒性受到屋面污染物影响较大。

图1 5月份不同采样时间屋面降雨径流的遗传毒性变化注：A, 剂量-效应曲线；B, 4-NQO当量浓度变化。Fig. 1 Genetic toxicity testing of roof rainfall runoff at different sampling times on MayNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

图2 5月份不同采样时间道路降雨径流的遗传毒性变化注：A, 剂量-效应曲线；B, 4-NQO当量浓度变化。Fig. 2 Genetic toxicity testing of road rainfall runoff at different sampling times on MayNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

5月份道路各采样时间段降雨径流的毒性变化如图2所示。从图2(A)中可以看出，在道路降雨径流产生的0.5 h内，水样剂量-效应线性拟合斜率先增大后减小。由图2(B)中可知，TEQ4-NQO先增加后减少，在前20 min内从40.1 ng·L-1大幅升高到177.6 ng·L-1，20～30 min时间段内从177.6 ng·L-1降为142.1 ng·L-1。图2与图1比较得出，5月份道路雨水样品的遗传毒性低于屋面雨水样品的遗传毒性。

图3展示了6月份不同采样时间屋面降雨径流的遗传毒性变化。图3(A)为6月份屋面降雨径流中各时间段雨水样品的遗传毒性剂量-效应曲线。从图中可知，在每个时间段内随着雨水样品含量的增加，水样剂量-效应线性拟合斜率逐渐增大。但随着降雨径流时间的持续，拟合斜率先增大后减小，降雨初期20 min达到最大。与5月份雨水样品毒性数据相比较小，推测可能是由于6月降雨量大，降雨之间的时间间隔较短，污染物的累积量也呈减少趋势。由图3(B)与图1(B)比较，可以得出2场降雨有相似的变化趋势，在降雨初期30 min内达到最大，随之逐渐降低，但6月份该场降雨在120 min时降雨强度瞬间增大，导致该时间段雨水样品的遗传毒性出现小幅度上升，但仍低于初期雨水样品的毒性，分别为55.0 ng·L-1(120～180 min)、64.7 ng·L-1(180～240 min)。

图3 6月份不同采样时间屋面降雨径流的遗传毒性变化注: A, 剂量-效应曲线；B, 4-NQO当量浓度变化。Fig. 3 Genetic toxicity testing of roof rainfall runoff at different sampling times on JuneNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

图4 6月份不同采样时间道路降雨径流的遗传毒性变化注：A, 剂量-效应曲线；B, 4-NQO当量浓度变化。Fig. 4 Genetic toxicity testing of road rainfall runoff at different sampling times on JuneNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

6月份道路各采样时间段降雨径流的毒性变化如图4所示，从图4(A)可知，在10～20 min内雨水样品剂量-效应线性拟合斜率最大，然后随着降雨时间的增加而逐渐减小。图4(B)也呈相似变化趋势，在前20 min内从121.0 ng·L-1升高到391.3 ng·L-1。

图5 屋面不同采样时间段遗传毒性效应曲线Fig. 5 Dose-effect curve of roof runoff of different sampling period

图6 道路不同采样时间段遗传毒性效应曲线Fig. 6 Dose-effect curve of road runoff of different sampling period

随着降雨时间的持续，降雨强度逐渐减小，TEQ4-NQO也逐渐降低至89.0 ng·L-1。

3 讨论(Discussion)

图5和图6为屋面和道路降雨过程中遗传毒性当量浓度的变化趋势，由于路面从开始降雨至产生径流需要一定的时间，所以采集样品的数量存在差异。由图中可知：屋面和道路2个下垫面在不同的降雨时期的同一时间段10～20 min 内TEQ4-NQO达到峰值，之后有持续下降的趋势，反映出下垫面对降雨径流水质的影响在初始冲刷现象最明显，初期雨水毒性最大。对比2图可得出：6月份道路雨水样品的遗传毒性大于5月份道路雨水样品的毒性，但是屋面相反，可能是5月份距上次降雨时间间隔大约2个月，屋面污染物聚集多，所以毒性较大；而道路由于定期清扫，受降雨时间间隔和季节影响不大，因而推测是由于5、6月之间道路进行翻新、温度升高以及雨水的冲刷作用，导致污染物浓度增大进而雨水样品的毒性增大。

致谢：感谢中国科学院生态环境研究中心魏东斌研究员提供试验菌株。

通讯作者简介：金星龙，男，教授，硕士生导师，主要研究方向为水污染控制及资源化，发表学术论文60余篇。

参考文献(References)：

[1] 鹿新高, 庞清江, 王伟峰, 等. 城市雨水资源化潜力及效益分析与利用模式探讨[J]. 水利经济, 2010, 28(1): 1-4

Lu X G, Pang Q J, Wang W F, et al. Potential benefit analysis and utilization mode of urban rainwater resources[J]. Journal of Economics of Water Resources, 2010, 28(1): 1-4 (in Chinese)

[2] 张莉莉, 李飞鹏, 姜月, 等. 城市降雨径流的毒性及影响因素研究进展[C]. 厦门: 中国环境科学学会学术年会, 2013, 5: 4124-4128

Zhang L L, Li F P, Jiang Y, et al. Toxicity and influence factors of urban rainfall runoff [C]. Xiamen: Chinese Society of Environmental Sciences Academic Annual Meeting, 2013, 5: 4124-4128 (in Chinese)

[3] Burton G A, Jr. The role of traditional and novel toxicity test methods in assessing storm water and sediment contamination [J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2000, 30(4): 413-447

[4] Tang J Y, Aryal R, Deletic A, et al. Toxicity characterization of urban storm water with bioanalytical tools [J]. Water Research, 2013, 47(15): 5594-5606

[5] 赵春桃. 基于生物毒性测试的水质安全评价方法及其应用研究[D]. 北京: 首都师范大学, 2014: 17-24

Zhao C T. Water quality safety evaluation method based on biological toxicity test and its application research [D]. Beijing: Capital Normal University, 2014: 17-24 (in Chinese)

[6] Lei B, Kang J, Wang X, et al. The toxicity of sediments from Taihu Lake evaluated by severalinvitrobioassays [J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2015, 22(5): 3419-3430

[7] Qian Y W, Yi L, Hong Y H, et al. Removal of genotoxicity in chlorinated secondary effluent of a domestic wastewater treatment plant during dechlorination [J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2012, 19(1): 1-7

[8] 黄金良, 杜鹏飞, 李梅香, 等. 澳门城市小流域地表径流污染特征分析[J]. 环境科学, 2006, 27(9): 1753-1759

Huang J L, Du P F, Li M X, et al. Characterization of urban surface runoff in two urban catchments in Macau [J]. Environmental Science, 2006, 27(9): 1753-1759 (in Chinese)

[9] 车武, 汪慧珍, 刘红, 等. 北京城区屋面雨水污染及利用研究[J]. 中国给水排水, 2001, 17(6): 57-61

Che W, Wang H Z, Liu H, et al. Research on rainwater pollution and utilization in urban roof runoff in Beijing [J]. China Water and Wastewater, 2001, 17(6): 57-61 (in China)

[10] 韩景超, 毕春娟, 吕金刚. 城市不同功能区径流中PCBs的污染特征及毒性评价[J]. 中国环境科学, 2013, 33(3): 546-552

Han J C, Bi C J, Lv J G, et al. Pollution characteristics and toxicological assessment of PCBs in urban runoff [J]. China Environmental Science, 2013, 33(3): 546-552 (in Chinese)

[11] 柳清, 张丽萍, 聂雪彪, 等. umu试验研究饮用水氯和氯胺消毒过程中遗传毒性的变化以及消毒条件的影响[J]. 环境科学, 2010, 31(1): 93-98

Liu Q, Zhang L P, Nie X B, et al. Genotoxicity of drinking water during chlorine and chloramine disinfection and the influence of disinfection conditions using the umu-test [J]. Environmental Science, 2010, 31(1): 93-98 (in Chinese)