伪狂犬抗原纯化浓缩工艺研究

刘国英 郝鹏 陈光达 李志鹏/金宇保灵生物药品有限公司

伪狂犬病毒（Pesudorabies virus，PRV）属于疱疹Ⅰ型病毒，PRV病毒粒子的核衣壳成正二十面体，带囊膜的成熟病毒粒子直径约120～300nm。自2011年以来，我国多地猪场暴发伪狂犬病，给我国养猪业带来了较大影响。目前，急需生产出高质量伪狂犬疫苗来应对疫情的威胁。传统的伪狂犬疫苗单位体积内抗原含量不高，免疫效果不佳；杂蛋白含量较多，免疫副反应较严重。本实验通过中空纤维纯化浓缩系统有效提高了每头份疫苗的抗原含量，降低了杂蛋白和内毒素含量，提升了疫苗品质。

一、材料和方法

1.PRV种毒、主要试剂和仪器。PRV种毒（Bartha K61株）由本公司保存并提供，500 KD中空纤维柱购自GE公司。

2.实验方案。（1）伪狂犬病毒原液离心。将悬浮培养收获的伪狂犬病毒原液离心，弃去细胞碎片等沉淀，取上清液备用。（2）伪狂犬毒液浓缩及洗滤。将离心后病毒上清液400L通过500 KDa中空纤维系统进行切向流过滤浓缩，浓缩倍数到5倍时，使用PBS溶液洗滤。洗滤结束后，最终体积达到40L，达到10倍浓缩效果。

3.病毒滴度的测定。取原液样、离心后样、浓缩后样品分别接种于铺满单层BHK细胞的96孔细胞板，每个稀释度接种8个孔，每孔100μl，置于在5% CO2，37℃条件下培养3～5日，根据Reed-Muench法计算每个样品的TCID50。

二、结果

1.杂蛋白去除率检测结果。杂蛋白去除率检测结果如表1所示，三批疫苗样品纯化浓缩后单位体积内杂蛋白含量虽然有所增加，但是总杂蛋白去除率分别达到了89.85%、89.82%、89.93%。

表1 蛋白含量检测结果

2.病毒滴度测定结果。三批疫苗样品纯化浓缩前后病毒滴度测定结果如表2所示。

批次 浓缩倍数原液样品TCID50/ml离心后样品TCID50/ml浓缩后样品TCID50/ml 1 10倍 8.00 7.75 8.75 2 10倍 8.25 8.25 9.13 3 10倍 7.75 7.50 8.63

三、讨论

本实验使用中空纤维纯化浓缩系统对三批伪狂犬病毒液进行10倍浓缩，纯化浓缩后的疫苗单位体积内抗原含量显著增加，杂蛋白含量显著降低。通过纯化浓缩有效的解决由于抗原含量低导致的抗体效价低和杂蛋白含量高导致副反应严重的问题。

三批伪狂犬病毒液虽然离心后有部分损失，但10倍纯化浓缩后，病毒滴度基本相应的增加了10倍。浓缩后单位体积内蛋白含量略有增加，但是总杂蛋白除去90%左右，配苗稀释后每头份疫苗中杂蛋白含量极低。

除了传统的纯化浓缩方法外，近些年出现的层析法纯化浓缩系统、GEM纯化浓缩技术等，成本高昂，技术不够成熟不适合工业化生产等缺点。目前中空纤维纯化浓缩系统在工业化生产中运用广泛，技术成熟。

参考文献（略）