猪瘟抗体镧系荧光免疫层析法的建立

王泽洲 ，王琴 ，赵启祖 ，吴俊清 ，章健 ，吴冠英

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 郫都 611731；3.中国兽医药品监察所，北京 100081）

猪瘟（CSF）是威胁我国养猪业的最重要的疫病之一，被列为一类动物传染病。长期以来，兽医工作者先后研究建立了中和试验、间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金技术等猪瘟检测方法，在CSF的诊断、流行病学调查和监测等方面发挥着重要作用[1-6]，但都存在着某些方面的不足。为此，本研究应用镧系元素作荧光标记物建立了一种既具有金标层析技术简单、方便、快捷，又具有ELISA准确、特异、敏感的猪瘟抗体镧系荧光免疫层析快检方法（LFICA）。

1 材料和方法

1.1 材料 CSFV E2蛋白、镧系荧光纳米微球和WellrayRWR-1608荧光仪（由成都微瑞生物科技有限公司研制），兔抗鸡IgY抗体、鸡IgY抗体，吸水纸、样品垫、硝酸纤维素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀亚胺，其他试剂均为国产分析纯。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒 2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）阳性血清由笔者单位保存。IDEXX试剂盒检测的阳性和阴性血清分别由中牧股份成都药械厂、华派生物药业有限责任公司惠赠；临床血清样品由四川省动物疫病预防控制中心提供。

1.2 制备 包被膜、抗原标记微球、夹心法建立等均参照试剂盒说明书或按照相关规范操作。

1.3 荧光免疫层析试纸条的组装 在湿度小于30%，温度20～25℃的环境下，把吸水纸、标记物垫和样品垫按顺序粘贴在聚氯乙烯底板上形成微反应体系，然后将其切割成0.5 cm宽，即成试纸条，将试纸条装入卡壳中制成检测卡，装入铝箔袋封存备用。

1.4 特异性试验 以建立的判断标准（标准曲线）与PRRSV、PCV-2、PRV、PPV、JEV、PEDV、TGEV、BVDV阳性血清进行猪瘟抗体镧系荧光免疫层析检测，同时设猪瘟阳性、阴性对照，以确定该试验方法是否发生交叉反应。

1.5 敏感性试验 将CSFV标准阳性血清作1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240倍稀释，每个稀释度平行做4个重复，用建立的猪瘟LFICA检测，将其换算成S/P值，判断其抗体检出效价。

1.6 重复性试验

1.6.1 批内重复性试验 在相同实验条件下，选取12份CSFV抗体水平不同的血清，每份血清样本平行做8个重复，用组装的CSFV-LFICA试剂盒检测，然后对检测结果进行统计学分析。

1.6.2 批间重复性试验 在相同实验条件下，选取12份CSFV抗体水平不同的血清，分别用4批CS FV-LFICA试剂盒检测，然后对检测结果进行统计学分析。

1.7 比较性试验

1.7.1 与IHA比较 血清样本同时进行IHA检测和CSFV-LFICA试剂盒检测，以IHA检测结果为标准，计算CSFV-LFICA相对于IHA的符合率、敏感性和特异性。

1.7.2 与国内外ELISA试剂盒比较 血清样本同时用IDEXX-ELISA试剂盒、法国LSI公司试剂盒、韩国JBT公司试剂盒、中监所ELISA试剂盒检测，分别以这些试剂盒的检测结果为标准，计算CSFV-LFICA相对于各个ELISA试剂盒的符合率、敏感性和特异性。

1.8 试剂盒的组装及保存期试验 CSFV-LFICA试剂盒由荧光检测仪、检测卡、连接线组成。试剂盒置4℃保存，于保存后 60、120、180、240、300、360、390d按照CSFV-LFICA的各个优化条件，对CSFV阳性和阴性参考血清进行检测，并对结果进行统计学分析。

1.9 应用 用研制的CSFV-LFICA试剂盒检测来自四川各地市的送检样本2366份，了解CSFV血清抗体阳性情况。

2 结果

2.1 测定条件的选择

2.1.1 标记量选择 把抗体/微球质量比不同的标记好的荧光微球稀释相同倍数，组装成检测卡，在检测卡加样孔分别加入80μL的参考标准液后，室温下层析15min，考察并验证不同标记量对标记结果的影响。随标记抗原浓度的增加，各浓度点的结合率呈现先增后降的趋势，在抗原/微球质量比为1∶25时出现最大值。因此，选择标记比例为1∶25的免疫微球进行后续试验。

2.1.2 加样量选择 在其他条件一致的情况下，考察并验证样本不同稀释倍数对检测结果的影响。在检测卡加样孔里分别加入稀释 10、20、30、40、50、60、70倍的参考标准液，室温下反应15 min，结果表明随稀释倍数的增加，各浓度点的结合率均减小。当样本稀释倍数为40倍时，继续降低稀释倍数，结合率增加不明显，免疫反应基本饱和。因此，后续试验选择样本稀释倍数40倍为加样量。

2.1.3 检测时间选择 在检测卡加样孔中加入80μL的参考标准液，室温下免疫层析，分别在5、10、15、20、25、30min时检测，考察不同检测时间对结果的影响。结果表明随着检测时间延长，各浓度点的结合率基本呈现增加的趋势，试纸静置15min检测即能达到较高的结合率，而随着检测时间的增加，各浓度点的结合率不再发生大的变化，趋于平稳，说明在15min时，试纸条上的双抗原夹心吸附基本达到饱和。因此，本着快速简便的原则，选择检测时间为加样后15min。

2.2 检测结果的判读 加样后，由于层析作用液体向前移动，先后与包被在T线和C线上的抗原形成复合物，这时，试纸条经荧光检测设备扫描显示2条荧光带。C线荧光扫描值基本一致，T线值随加样中抗体浓度的增加而升高。相应的检测结果以浓度为横坐标，荧光值信号为纵坐标，经对数函数数据处理程序拟合得到标准曲线。当样本为阴性时，CSFV抗体浓度很低，T线荧光值很低或完全检测不到；当样本为阳性时，CSFV抗体浓度越高，T线荧光值也越高。无论是阳性还是阴性结果，C线总能显示荧光，如果C线没有荧光显现，无论T线有无，检测结果均无效。

2.3 CSFV-LFICA的方法学评估

2.3.1 特异性试验 用CSFV E2蛋白和全病毒建立的CSFV-LFICA试剂盒检测7种常见猪病及BVDV阳性血清，其荧光比值均低于0.40，呈阴性反应。表明该方法与7种常见猪病及BVDV阳性血清不发生交叉反应，显示出很好的特异性。

2.3.2 敏感性试验 检测CSFV标准阳性对照血清，当血清稀释至10240倍时，荧光检测仍为阳性。用同一份阳性血清同时做ELISA和CSFV-LFICA比较，后者比前者高1～2个滴度，证明该方法敏感性很好。

2.3.3 重复性试验 批内重复性试验的变异系数小于10%,批间重复性试验的变异系数均小于15%，表明CSFV-LFICA具有良好的重复性。

2.3.4 与IHA作比较 在IHA检测结果为阳性的128份血清样本中，用CSFV-LFICA检测出111份阳性，17份阴性；在IHA检测结果为阴性的46份血清样本中，用CSFV-LFICA检测出38份阴性，8份阳性。CSFV-LFICA与IHA的符合率为85.6%，敏感性为86.7%，特异性为82.6%。

2.3.5 与国内外ELISA试剂盒作比较 同一份血清用CSFV-LFICA与其他四种试剂盒同时检测，结果见表1。

表1 CSFV-LFICA与其他试剂盒的检测比较

2.3.6 试剂盒保存期试验 统计学分析表明，CSFVLFICA试剂盒在保存390d后检测阳性血清、阴性血清、P/N值，其变异系数均小于10%，说明该诊断试剂在保存12个月以上后仍然稳定有效，进一步的稳定性试验还在进行中。

2.4 现场应用试验 应用CSFV-LFICA试剂盒检测来自四川各地市的2366份送检样本，结果检出血清抗体阳性2053份，阳性率为86.77%。

3 讨论

3.1 镧系荧光免疫层析法（LFICA）是在时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）基础上建立起来的一种超微量快速免疫检测技术，它集合了酶标记技术、放射标记技术和同位素标记技术的优点，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、无污染，且测定范围宽，试剂盒寿命长，操作简单和无放射性等优点，越来越受到各领域科研工作者的关注。在医学界已有文献报道，在兽医学领域才起步，需要研究的内容和范围还很多[7]。

3.2 CSFV全病毒或E2蛋白的纯度与含量是诊断试剂研制的基础，直接关系到所建立方法的特异性和敏感性。客观上说，市售产品纯度和质量参差不齐，批次之间或有差异，因此，在使用前进行检定是非常必要的。

3.3 本研究采用镧系元素铕（Eu）作为荧光物质，与传统荧光物质相比，铕具有独特的荧光光谱特性：Stokes位移大、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命很长[8]。由此建立的荧光方法特异性更强、敏感性更高，检测结果更加准确可靠。荧光纳米微球的大小和均匀度也是影响快检试纸条的重要因素，本试验用的微球粒径为70～200nm。微球表面经过羧基（或氨基）活化处理，易与蛋白或抗体共价偶联，牢固结合，使标记物的稳定性提高，微球表面积比增大，大大提高了蛋白质的包被量。每个微球可包裹成千上万个荧光分子，使标记效率和灵敏度大大提高。

3.4 从CSFV-LFICA方法学评估可以知道，该方法的特异性、敏感性和重复性都较好。与国内中监所和国外IDEXX公司、西班牙的ELISA试剂盒检测结果相比，符合率和敏感性都在90%以上，表明该方法完全可以用于CSF免疫抗体检测。

4 小结

ELISA是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，是检测猪瘟抗体的主要方法，具有敏感性和特异性强、操作简单、检测相对快速、检查微量、无辐射、高通量等优点，但需要比较完备的实验设备，操作人员也得有一定的专业技术水平和经验，且检测流程至少需要2～4h，故对基层兽医站和一般的养殖场不适用。猪瘟正向间接血凝试验（IHA）是农业部推荐的猪瘟抗体检测方法，该法操作简单，不需要特殊的仪器设备，但敏感性低，待检血清需经灭活处理，增加了检测时间和难度，且血清质量严重影响检测结果，而肉眼判定结果又增加了主观性和不准确性。胶体金免疫层析法（GICA）是近年来发展起来的一种快速检测方法，操作简单，使用方便，不需要特殊仪器，肉眼直接观察和判定结果，全程只需要几分钟，但敏感性、重复性不高，产品质量参差不齐，漏检率和误诊率较高。

本研究建立的CSFV-LFICA，既具有胶体金免疫层析法（GICA）简单、方便、快捷等优点，又具有ELISA法敏感、特异、微量等优点，检测时间从2～4h缩短到十多分钟，且检测设备小巧便于携带。笔者认为，该方法适于在基层兽医部门、养殖场推广应用。

[1] 李树春，何建新，李德珍，等.猪瘟间接血凝试验的研究[J].中国兽医科技，1993，23（7）：3-6.

[2] 张改平，郭军庆，李青梅，等.动物疫病免疫试纸快速检测技术概述[J].河南农业科学，2009（9）：174-176.

[3] 余兴龙，涂长春，李作生，等.以重组mE2蛋白为抗原建立检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法的研究[J].中国预防兽医学报，1999，21（3）：220-222.

[4] 徐璐，范学政，梁智选，等.猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的临床应用研究[J].中国兽医杂志，2014，50（8）：36-41.

[5] 李娇，王金良，祖立闯，等.猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用[J].中国兽医学报，2009，31（10）：1390-1394.

[6] 杨明，陈伯祥，孙晓林，等.猪瘟胶体金诊断试纸条的研制[J].甘肃农业大学学报，2010，45（2）：34-37.

[7] 王泽洲，吴俊清，张永宁，等.时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展[J].四川畜牧兽医，2015，42（7）：34-37.

[8] 郭明明，周衍，周建波，等.荧光微球时间分辨免疫层析技术定量检测甲胎蛋白的研究[J].免疫学杂志，2015，31（10）：897-901.