连续性血液透析滤过对急性重症胰腺炎大鼠肠上皮细胞凋亡和肠功能障碍的影响

王 锋，刘 杰,黄仲俊

(1. 湖北省丹江口市第一医院,湖北 丹江口 442700；2. 湖北医药学院附属人民医院，湖北 十堰 442000)

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)属于临床中发生率较高的急危重症之一，具有发病迅速、疾病进展快、致死率高等特点[1]。SAP发病不仅限于胰腺本身，往往还会累及包括肠道在内的全身多个脏器，肠黏膜屏障功能受损，表现为细胞非正常凋亡增加，而上皮细胞增殖与凋亡之间的动态平衡决定了肠黏膜上皮功能能否处于稳定状态[2-3]。已有报道指出，连续性血液透析滤过能够非选择性的清除炎症递质，保持血流动力学处于相对稳定的状态，用于治疗多脏器功能不全等疾病疗效较好[4-5]。本研究通过将5%牛磺胆酸钠逆行注射于大鼠胆管制备SAP模型后采取连续性血液透析滤过进行干预，旨在探讨连续性血液透析滤过对SAP大鼠肠上皮细胞凋亡和肠功能障碍的影响。

1 实验资料

1.1实验动物与分组 选择SPF级SD大鼠54只，体质量280～300 g。将54只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、血液透析滤过组，每组18只。

1.2实验方法 术前全部大鼠禁食12 h，自由饮水；腹腔内注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠；固定、消毒、上腹正中切口剖腹，于十二指肠内侧见片状分布的胰腺，模型组和血液透析滤过组用无损伤动脉夹夹闭肝门部胆管，从胆胰管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁穿刺扎入导管，导管插入胆胰管约1 cm，逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1 mL/100 g， 0.1 mL/min)，推注完毕后用无损伤动脉夹夹闭。10 min后，去除动脉夹，缝合。假手术组仅做剖腹术，并轻翻动胰腺组织后关腹。关腹后，假手术组和模型组大鼠皮下注射生理盐水。血液透析滤过组大鼠术后立刻给予连续性血液透析滤过12 h，方法：采用智能化床旁肾脏替代治疗机(瑞典PRISMA-TM型)和AN-69型血滤器(可滤分子范围20～30 000 D，膜面积0.9 m2)，选用股静脉留置单针双腔导管建立血管通路，透析液流速2 500 mL/h，血流量180 mL/min，置换液流速2 000 mL/h；采用滤器前肝素抗凝法，用生理盐水(含5 000 IU/L肝素)1.5 L预冲，首次肝素剂量1 000 IU/kg，后续肝素剂量2 kIU/h。

1.3检测指标 分别于术后12 h、24 h、48 h每组各处死6只大鼠，取门静脉血，采用鲎试剂定量动态比浊法检测血浆内毒素含量；取肠黏膜组织，采用免疫组化法检测凋亡因子Apaf-1、Bcl-2阳性表达率和肠黏膜上皮细胞凋亡指数；取各组大鼠胰腺、腹水、肠系膜淋巴结以及肝脏组织，进行细菌培养。上述操作全部遵循无菌原则。

2 结 果

2.13组大鼠术后各时间点肠黏膜上皮细胞凋亡因子表达情况 假手术组术后各时间点Apaf-1、Bcl-2阳性表达率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。术后12 h，模型组和血液透析滤过组Apaf-1阳性表达率均明显高于假手术组(P均<0.05)，Bcl-2阳性表达率均明显低于假手术组(P均<0.05)；随着距离手术时间的增加，模型组和血液透析滤过组Apaf-1阳性表达率均呈下降趋势，但仍高于假手术组(P均<0.05)；Bcl-2阳性表达率呈增高趋势，但仍低于假手术组(P均<0.05)。血液透析滤过组术后各时间点Apaf-1阳性表达率均明显低于模型组(P均<0.05)，Bcl-2阳性表达率均明显高于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠术后各时间点Apaf-1、Bcl-2阳性表达率比较

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.23组大鼠术后各时间点肠黏膜上皮细胞凋亡指数比较 假手术组术后各时间点肠黏膜上皮细胞凋亡指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组术后各时间点肠黏膜上皮细胞凋亡指数均明显高于假手术组与血液透析滤过组(P均<0.05)；随着距离手术时间的增加，模型组和血液透析滤过组肠黏膜上皮细胞凋亡指数均呈下降趋势；术后24 h、48 h，血液透析滤过组肠黏膜上皮细胞凋亡指数与假手术组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 3组大鼠术后各时间点肠黏膜上皮细胞凋亡指数比较

注：①与模型组比较，P<0.05。

2.33组大鼠术后各时间点门静脉血浆内毒素含量比较 假手术组术后各时间点门静脉血浆内毒素含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；模型组术后各时间点门静脉血浆内毒素含量均明显高于假手术组与血液透析滤过组(P均<0.05)；随着距离手术时间的增加，血液透析滤过组血浆内毒素含量呈下降趋势，术后24 h、48 h时血浆内毒素含量与假手术组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 3组大鼠术后各时间点门静脉血浆内毒素含量比较

注：①与模型组比较，P<0.05。

2.43组大鼠各时间点细菌培养情况比较 假手术组大鼠术后各时间点均未发现阳性细菌；在胰腺、腹水、肠系膜淋巴结以及肝脏中，血液透析滤过组各时间点细菌培养阳性率均明显低于模型组(P均<0.05)。见表4。

表4 模型组与血液透析滤过组大鼠各时间点细菌培养阳性率比较 %

注：①与模型组比较，P<0.05。

3 讨 论

SAP发病凶险，机体处在严重的应激状态下，氧自由基、继发肠道缺氧缺血以及各种炎症因子大量生成，破坏了肠黏膜上皮，导致肠黏膜屏障功能损伤[6]；且SAP发生后往往伴随持久且严重的肠麻痹，而细菌发酵产气以及肠内容物的停滞可导致肠内压力增高，造成黏膜血流降低以及黏膜损伤，具体表现在肠黏膜的形态学发生变化、肠黏膜通透性增加以及肠道细菌与内毒素发生移位[7-9]。其中肠黏膜屏障功能损伤的主要分子生物学基础之一即肠黏膜上皮细胞凋亡增加。在线粒体的凋亡过程中，Apaf-1是其中主要的促凋亡因子之一。死亡刺激直接诱导线粒体内膜间的细胞色素C释放入胞质中，胞浆中的Apaf-1与细胞色素C相结合，Apaf-1寡聚化后募集procaspase-9，共同组成凋亡体，最终引起细胞发生不可逆转的凋亡[10-11]。Bcl家族蛋白在细胞凋亡过程中扮演着重要角色，其中Bcl-2是线粒体凋亡过程中主要抑凋亡因子之一，其可通过在线粒体质膜上结合，对线粒体起到稳定作用[12]。

本研究结果显示，术后12 h，模型组和血液透析滤过组Apaf-1阳性表达率和肠黏膜上皮细胞凋亡指数均明显高于假手术组、Bcl-2阳性表达率明显低于假手术组，说明在SAP早期肠黏膜上皮细胞即发生了严重凋亡；随着距离手术时间的增加，模型组和血液透析滤过组Apaf-1阳性表达率和肠黏膜上皮细胞凋亡指数呈下降趋势，Bcl-2阳性表达率呈增加趋势，血液透析滤过组肠黏膜上皮细胞凋亡指数接近假手术组。血液透析滤过组术后各时间点门静脉血浆内毒素含量和胰腺、腹水、肠系膜淋巴结、肝脏中细菌培养阳性率均明显低于模型组，说明肠黏膜屏障功能出现障碍时，其肠上皮细胞之间的间隙增加，最终发生细菌以及内毒素移位，而给予连续性血液透析滤过干预可明显缓解肠道内毒素以及细菌移位情况。

综上所述，连续性血液透析滤过能够抑制急性重症胰腺炎大鼠肠上皮细胞通透性，可有效改善肠功能障碍，并具有抑制内毒素与细菌移位的作用。连续性血液透析滤过改善肠功能的作用机制可能是其可清除肠道内的内毒素以及细菌，从而调节肠道内部微生态的失衡，保障了肠道机械屏障的完整。

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