高温胁迫诱导烟草对TMV的抗性效应研究

2018-06-19李成军孟颢光李淑君白静科蒋士君

延边大学农学学报 2018年1期

李成军，孟颢光，高崇，李淑君，白静科，蒋士君*

(1.烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室，河南省农业科学院烟草研究所，河南许昌 461000；2.河南农业大学植物保护学院，河南郑州 450002；3.延边农业科学院，吉林龙井 133400)

长期以来，由烟草普通花叶病毒病(TMV)和烟草黄瓜花叶病毒病(CMV)引起的烟草病毒病在全国各烟叶产区普遍发生，严重影响烟叶生产，导致烟叶质量和产量的下降。目前防治烟草病毒病主要以化学药剂为主，其农药残留大，使生态环境遭到破坏。因此，探索烟草病毒病的绿色防控手段就显得尤为重要，对烟叶生产的可持续发展、烟叶安全性的提高和质量的改善具有重要意义[1-2]。

据相关报道，植物感染病毒后在特定的高温环境条件下，由于寄主的特殊理化状态，症状可暂时隐去或有一定程度的减轻,这种现象称为高温隐症或隐潜(masking)，又称为高温恢复(recovery)[3-8]。

本文主要通过室内盆栽试验和大田示范验证研究高温诱导烟株对TMV和CMV的抗性效果，筛选出烟草抗TMV和CMV的适宜高温诱导条件。同时，初步研究分析高温处理对TMV的致病性及遗传特异性的影响，为烟草病毒病绿色防控技术手段的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烤烟(NicotianatabacumL.)品种为K326；供试毒源为纯化的TMV。

1.2 试验设计

1.2.1 室内盆栽试验

高温诱导烟草对TMV的抗性效应试验设置5个处理，T1为接种后5 d(未发病)高温处理；T2为接种后10 d(轻微发病)高温处理；T3为先高温处理后再接种；CK1、CK2、CK3为对照(接种不高温处理)。每个处理3次重复，每个重复10株烟苗。

选择生长状况一致的5～6片真叶无毒K326烟苗，采用相同浓度的TMV接种烟苗上部第2片展开叶，高温处理在45 ℃恒温光照培养箱中培养24 h。高温处理后的烟苗置于常温光照培养室中培养，观察记载高温处理后5、10、15、20、25 d烟株发病情况，计算发病率、病情指数和抑制效果[3-9]。发病时间的判别依据是新叶出现明脉或轻度斑驳。严重度分级标准参照烟草花叶病分级标准(GB/T23222)[2-4]。

1.2.2 大田试验

选择中烟100移栽后30 d的1、3、5级花叶型病株进行高温恢复试验。共设置4个处理，A为45 ℃ 5 h*1 d(45 ℃左右条件下处理5 h)；B为45 ℃ 5 h*3 d(45 ℃左右条件下处理5 h，连续处理3 d)；C为45 ℃ 5 h*5 d(45 ℃左右条件下处理5 h，连续处理5 d)。同时设置不高温处理的发病烟株为对照(CK)，每个处理10株，重复3次。高温处理方法为日光加热罩袋(PVC袋)法[5-6]。高温后20 d调查不同处理发病情况，统计分析高温处理对病害抑制效果和烟株生长的促进效果[9]。严重度分级标准参照烟草花叶病分级标准(GB/T23222)[2-4]。

1.2.3 高温胁迫处理对烟株体内病毒致病性和TMV CP的影响

选择生长状况一致，5～6片真叶且健康无毒的K326烟苗进行接种，在接种后10 d对烟苗进行高温处理，处理温度和时间分别为45 ℃、24 h。以接种不高温处理烟株为对照(CK),处理后的烟苗置于光照培养室中培养。具体试验设计如下。

1) 先取接种后高温处理烟株(T)和对照(CK)烟株同叶位同面积叶片分别研磨制备成10倍病毒液,然后将制备的病毒液回接到健康无毒烟苗上测定其致病性，分别在接种后10、20 d调查烟株发病率和发病程度，计算病情指数[2-4]。每个处理设3次重复，每个重复10株烟苗。

2) 分别对接种后高温处理烟株、接种不高温处理烟株进行TMV CP提取并进行SDS-PAGE电分析[10]，以纯化的TMV作为阳性对照，以无毒烟株作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫处理诱导烟苗对TMV的抗性恢复分析

由表1,2可知，T1和T2处理烟株对TMV表现出显著的抑制效果，在高温处理后15 d对TMV的抑制效果分别为100%和72.36%,在高温处理后20 d对TMV的抑制效果分别为97.62%和67.24%,在高温处理后25 d对TMV的抑制效果分别为82.57%和60.19%，抑制效果分别显著好于对照，且T1处理对TMV的抑制效果好于T2处理。从发病时间来看，T1处理在接种后20 d才开始表现出症状，发病时间比对照CK1晚18 d。表3结果表明，T3处理对TMV的抑制效果较差，与对照相比无显著差异。

表1 接种后5 d高温处理对TMV抑制作用

表2 接种后10 d高温处理对TMV抑制作用

表3 先高温后接种对TMV抑制作用

2.2 高温胁迫处理诱导大田病株对TMV的抗性恢复分析

由表4可知，田间病株经不同时间的高温处理后对TMV表现出不同程度的抑制和抗性恢复效果。连续5 d高温处理效果显著好于连续3 d和1 d高温处理，试验证明，随着高温处理时间的延长对TMV的抑制和生长恢复效果越好；严重度较低的病株(1级和3级)更易高温诱导获得显著的寄主恢复，对TMV的抑制效果和抗性恢复效果均好于严重度较高的病株(5级)。高温处理后会导致烟株短期内生长较慢,但后期生长发育和对照无差异。

表4 高温胁迫处理诱导烟株对TMV抗性恢复效果

2.3 高温胁迫处理对接种烟株体内病毒的致病性和TMV CP的影响

2.3.1 高温胁迫处理对接种烟株体内病毒致病性的影响

由表5可知，从处理(T)和对照(CK)烟株体内提取的病毒接种普通烟K326烟苗后，发病所需时间分别为7.33 d和7.67 d，在接种后10 d发病率均为100%，病情指数分别为11.85和12.59，在接种20 d后病情指数分别为40.74和41.48。方差分析结果表明，处理烟株和对照烟株体内TMV提取液对寄主的致病表征方面无显著差异。

表5 高温胁迫后烟株体内TMV致病性测定

2.3.2 高温胁迫处理对接种烟株体内TMV CP的影响

由图1可知，接种后高温处理烟株、接种后不高温处理烟株和阳性对照在17.5 KDa处均有1条带出现，而阴性对照不存在,表明高温胁迫处理未导致接种烟株体内TMV CP的破坏。

1.Marker 2. 阳性对照 3. 接种后高温处理

3 讨论与结论

植物病毒高温恢复是一种普遍的自然现象，植物在受到病毒侵染后在特定的高温环境条件下，症状可暂时隐去或表现一定程度的症状减轻，但以烟草-TMV为体系的研究较少，对抗性恢复的高温诱导条件不够明确。

本文以烟草-TMV作为研究体系进行了较系统的研究，通过室内盆栽试验和大田试验研究明确了烟草病毒病高温恢复的诱导条件，为烟叶生产中病毒病的绿色防控提供了理论依据。同时对高温诱导烟草抗TMV的有关机制进行了初步的研究探索，研究表明，高温诱导烟草抗TMV并不是温度对烟株体内TMV直接作用的结果，而是高温影响了烟草-TMV的互作，激发了寄主的抗病毒防卫反应。

高温胁迫诱导寄主植物产生抗病性存着复杂的抗病机理，高温条件下，植物除产生一系列的生理反应以抵抗高温胁迫外，其抗病反应也发生复杂的变化。伴随着诸多代谢物质的产生[11-16],高温胁迫可诱导寄主植物体内产生一类能抗高温的蛋白质[17-20]，但这类高温诱导产生的蛋白在抵抗病毒的侵入和扩展等方面是否发挥作用有待于进一步深入系统的研究[11-14]。

参考文献：

[1] 马国胜，何博如.烟草病毒病的发生与防治研究进展[J].河南农业科学,2005(02):42-46.

[2] 郭生国，梁嘉勋，林桂华,等.烟草病毒病综合防治技术研究[J].中国烟草科学，2004，25(1)：21-24.

[3] 裘维蕃.植物病毒学(修订版)[M].北京：农业出版社,1984.

[4] 田波,裴美云.植物病毒研究法[M].北京:科学出版社,1987.

[5] Qayouma A,Line R F.High-temperature adult plant resistant to stripe rust of wheat[J].Phytopathology,1985,75:1121-1125.

[6] 商鸿生.小麦对条锈病的高温抗病性研究[J].中国农业科学,1998，31(4)：46-50.

[7] 王利国,商鸿生，井金学，等.高温抗条锈性小麦品种的筛选和鉴定[J].西北农业学报,1995，4(01)：35-38.

[8] 商鸿生，王利国.小麦对条锈病高温抗病性表达规律的研究[J].植物保护学报,1997,24(2):97-100.

[][]

[9] 刘太国，李永镐，石延霞，等.非(弱)杀菌化学物质诱导烟草对病毒病(TMV)抗性的研究[J].东北农业大学学报,2002,33(2):129-133.

[10] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社，2004.