酸性环境抑制高磷诱导大鼠VSMCs钙化的机制研究*

耿同会，徐金升，韩迎迎，白亚玲，张俊霞，崔立文，张胜雷

（河北医科大学第四医院 肾内科，河北 石家庄 050011）

慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）患者心血管疾病发病率是普通人群的10～30倍[1]，血管钙化为主要危险因素[2]。血管钙化是细胞介导的生物矿化过程[3]，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）表型转化是其重要机制[4]。代谢性酸中毒是CKD患者常见的并发症。研究发现，酸性环境可抑制大鼠血管钙化，但具体机制尚不明确[5]。活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells, NFAT）是一种有多种调控作用的转录因子，GOETTSCH等[6]发现，NFATc1对血管钙化有促进作用。因此笔者推测，酸性环境可能通过下调NFATc1表达，抑制血管钙化。本实验以大鼠VSMCs为研究对象，旨在探讨酸性环境对高磷诱导大鼠VSMCs钙化的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6只4周龄健康雄性SD大鼠，原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞，大鼠购自河北医科大学实验动物中心，动物合格证标号：1305090。

1.1.2 主要仪器和试剂 倒置相差显微镜（LH50A型）（日本Olympus公司），CYTATION3型酶标仪（美国Biotek公司），胎牛血清﹑细胞培养基购自美国Gibco公司，β－甘油磷酸（美国Sigma公司），酸度计（北京赛多利斯科学仪器有限公司），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性试剂盒（南京建成生物工程研究所），钙含量测定试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司），RNA提取试剂盒﹑RNA逆转录试剂盒（美国Thermo公司），PCR引物（上海英潍捷基公司），NFATc1﹑Runt相关转录因子2（runt related transcription factor 2, Runx2）抗体购自英国Abcam公司，GAPDH抗体（美国Bioworld公司）。

1.2 方法

1.2.1 钙化VSMCs的制备及分组 取4周龄健康雄性SD大鼠的胸主动脉，采用组织块贴壁法培养原代VSMCs，实验取3～5代细胞。采用随机数字表法，将VSMCs随机分为正常对照组﹑高磷＋pH 7.4组﹑高磷＋pH 7.1组。正常对照组用含10%胎牛血清培养基培养，调整pH值至7.4；高磷＋pH 7.4组在10%胎牛血清培养基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸，调整pH值至7.4；高磷＋pH 7.1组用高磷培养基，调整pH值至7.1。使用1 mol/L盐酸HCl和7.4%碳酸氢钠调整培养基pH值，换液1次/24 h。

1.2.2 细胞钙含量测定 将24孔板内培养的细胞干预14 d后，弃上清液，用1 mmol/L HCl消化过夜，取上清，使用邻甲酚酞络合酮比色法测定钙含量；细胞用0.1 mol/L氢氧化钠溶液和0.1%十二烷基硫酸钠溶解30min，根据吸光度值计算细胞蛋白含量。VSMCs的钙含量结果用细胞钙含量与蛋白含量的比值表示（mg/g）。

1.2.3 茜素红染色 取4～5代细胞以5×104个/孔密度接种于24孔板内，干预14 d。用pH 8.4浓度为0.1%的茜素红染液进行钙化染色，倒置显微镜下观察照相。结果判断标准：钙盐沉积为橘红色。

1.2.4 ALP活性测定 将细胞培养14 d后弃上清，磷酸盐缓冲溶液冲洗2次，加入1%聚乙二醇辛基苯基醚生理盐水，置于4℃冷藏24 h后离心，取上清液，按ALP活性试剂盒说明书操作，测定其活性，结果用蛋白质校准。

1.2.5 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR） RT-PCR检测VSMCs目的基因的表达。干预4 d后提取各组细胞mRNA，测定NFATc1和Runx2基因的表达。PCR引物由Primer 5.0软件设计，引物序列见表1。PCR反应体系为20μl，NFATc1反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32个循环；GAPDH反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共32个循环；Runx2反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共28个循环，72℃继续延伸10min。实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测 Western blot检测VSMCs目的蛋白的表达。干预4 d后提取各组细胞蛋白，测定NFATc1和Runx2蛋白的表达。细胞蛋白质用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜﹑封闭，加入一抗稀释液（NFATc1 1∶1 000，Runx2 1∶500，GAPDH 1∶5 000），4℃孵育过夜。洗膜，放入二抗稀释液（1∶5 000），室温下孵育1 h，定影显色，分析条带灰度值。实验重复3次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验；相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酸性环境对高磷诱导VSMCs钙化的影响

干预14 d后，正常对照组﹑高磷＋pH 7.4组﹑高磷＋pH 7.1组VSMCs的钙含量分别为（47.423±10.515）﹑（119.306±13.443） 和（89.738±12.542）mg/g，经方差分析，差异有统计学意义（F=22.138，P=0.0017）。进一步两两比较经SNK-q检验，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。高磷环境下大鼠VSMCs钙含量水平升高；pH值降低时VSMCs钙含量减少。

与钙含量结果类似，茜素红染色可见正常对照组VSMCs无橘红色钙盐结节出现，高磷组有大量橘红色钙盐沉积，而酸干预可使钙盐沉积减少。见图1。

2.2 酸性环境对高磷诱导VSMCs表型转化的影响

正常对照组﹑高磷＋pH 7.4组﹑高磷＋pH 7.1组VSMCs的ALP活性分别为（32.510±2.393）﹑（106.206±4.294）和（85.715±6.227）u/g，经方差分析，差异有统计学意义（F=40.909，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。高磷＋pH 7.4组ALP活性高于正常对照组；酸干预后ALP活性降低。

正常对照组﹑高磷+pH 7.1组﹑高磷+pH 7.4组VSMCs的Runx2 mRNA相对表达量分别为（0.213±0.008）﹑（0.317±0.054）和（0.562±0.070），经方差分析，差异有统计学意义（F=36.924，P=0.000）。正常对照组﹑高磷+pH 7.1组﹑高磷+pH 7.4组VSMCs的Runx2 蛋白相对表达量分别为（0.390±0.108）﹑（0.785±0.069）和（1.095±0.121），经方差分析，差异有统计学意义（F=36.408，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，正常对照组﹑高磷＋pH 7.1组Runx2 mRNA和蛋白表达水平较高磷＋pH 7.4组低（P＜0.05），表明酸性环境可下调Runx2表达。见图2。

2.3 酸性环境对高磷诱导的VSMCs中NFATc1表达的影响

正常对照组﹑高磷+pH 7.1组﹑高磷+pH 7.4组VSMCs的NFATc1 mRNA相对表达量分别为（0.264±0.043）﹑（0.419±0.073 ）和（0.668±0.097），经方差分析，差异有统计学意义（F=22.512，P=0.002）。正常对照组﹑高磷+pH 7.1组﹑高磷+pH 7.4组VSMCs的NFATc1蛋白相对表达量分别为（0.155±0.066）﹑（0.362±0.031）和（0.661±0.096），经方差分析，差异有统计学意义（F=36.408，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，正常对照组﹑高磷＋pH 7.1组NFATc1 mRNA和蛋白表达水平较高磷＋pH 7.4组低（P＜0.05），高磷环境NFATc1表达升高。见图3。

2.4 NFATc1与Runx2、ALP的相关性

VSMCs中NFATc1与Runx2表达呈正相关（r=0.801，P=0.003），NFATc1与ALP活性呈正相关（r=0.698，P=0.002）。

图1 各组大鼠VSMCs钙盐沉积 （茜素红染色）

图2 各组大鼠VSMCs的Runx2 mRNA和蛋白的表达

图3 各组大鼠VSMCs的NFATc1 mRNA和蛋白的表达

3 讨论

代谢性酸中毒是CKD患者的常见并发症。近期研究发现，代谢性酸中毒可以抑制VSMCs表型转化[4]。近年来就酸性环境对骨形成的作用研究较为深入，然而其对血管钙化的作用研究甚少，仅证实VSMCs成骨/成软骨表型转化是其重要机制之一[7]，因此，可将酸性环境对成骨作用的影响推演到血管钙化上。血管钙化是CKD患者发生心血管疾病的重要危险因素，不同于普通人群发生的动脉粥样硬化，CKD患者以血管中膜钙化为突出表现[8]。VSMCs作为血管中膜的重要成分，在血管钙化发生过程中起重要作用。本实验通过体外培养VSMCs，深入探讨酸性环境对VSMCs钙化的影响，发现与正常对照组相比，高磷刺激加重VSMCs钙化，酸刺激可抑制高磷诱导的VSMCs钙化。

血管钙化是多因素共同参与的复杂病理过程，其发病机制尚未完全清楚。血管钙化常常伴随Runx2和ALP等成骨相关蛋白的表达[7]。Runx2是Runt结构域基因家族一员，可结合成骨细胞特异性顺式作用元件，调控下游骨基质和骨胶原的产生，参与成骨细胞分化[7]。ALP亦是成骨细胞形成的早期标志物。两者在正常VSMCs中表达较低，在钙化的血管和心脏瓣膜组织中表达升高[9]。因此，可以凭借VSMCs中Runx2的表达量和ALP活性推测其是否发生成骨样表型转化。本研究结果显示，与高磷＋pH 7.4组相比，高磷+pH 7.1组VSMCs的Runx2表达和ALP活性降低，提示高酸性环境抑制VSMCs钙化的机制可能是抑制VSMCs发生成骨样表型转化。

NFAT最初在T细胞中因其免疫调控作用被发现，之后发现除免疫系统外，NFAT转录因子在其他组织也有广泛分布，如心肌﹑骨骼肌﹑卵巢等组织，具有多种生理功能，如参与刺激T细胞活化﹑成骨细胞分化和成骨作用﹑破骨细胞分化，调控内皮细胞及VSMCs增殖[10]。NFAT家族蛋白活性主要由Ca2+/钙调神经磷酸酶（Calcineurin, CaN）调节。当Ca2+﹑钙调节蛋白与CaN结合后诱发CaN构象改变，使自身抑制域移位，暴露出活性位点，导致CaN活化，继而使细胞浆中NFAT脱磷酸化，暴露其核定位信号，NFAT得以转位入核，与核内其他转录因子协同调节多种基因的活化[11]。研究表明，在VSMCs中，NFATcl高表达，NFATc3少量表达，而NFATc2和NFATc4几乎不表达[12]。有研究发现，在氧化低密度脂蛋白诱导VSMC钙化过程中，NFAT发挥重要作用，敲除NFAT基因能抑制Runx2表达和基质矿化[6]。以上研究表明，NFATc1在血管钙化中发挥重要作用，因此笔者推测NFATc1可能参与酸抑制VSMCs钙化的过程。本研究从体外实验观察VSMCs中NFATc1的表达，结果发现高磷＋pH 7.4组VSMCs中NFATc1表达高于正常对照组，提示NFATc1参与慢性肾衰竭大鼠血管钙化的发生，可能对其有促进作用；进一步比较发现，酸性环境能够抑制VSMCs中NFATc1 mRNA和蛋白的表达，由此推测NFATc1可能是酸抑制VSMCs钙化发生的因素之一。

NFATc1在酸抑制高磷诱导的VSMCs钙化中如何发挥作用？本研究就VSMCs中NFATc1蛋白表达水平与表型转化指标（ALP活性和Runx2蛋白表达水平）做相关性分析，结果发现NFATc1与Runx2蛋白表达﹑ALP活性呈正相关。因此，笔者推测酸抑制VSMCs发生钙化的可能机制是通过降低NFATc1表达，抑制VSMCs发生表型转化来实现的。

综上所述，本研究通过体外研究发现，酸性环境可以抑制高磷诱导的大鼠VSMCs钙化，其可能机制是通过降低NFATc1表达，抑制VSMCs发生表型转化来实现的。但本研究仅从实验室内观察到NFATc1在酸抑制血管钙化中的作用，具体机制仍需进一步实验研究，以期为临床预防和治疗CKD患者的血管钙化提供新靶点。

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