LMP1经Wnt1/β—catenin途径促进鼻咽癌干细胞SP18增殖

周业 张和良 刘重元 罗招阳 张志伟

摘 要：目的 探讨LMP1羧基端功能活性区促进鼻咽癌干细胞SP18增殖作用机制。方法 采用生长曲线、平皿克隆形成实验与软琼脂集落实验分析LMP1TRADD对SP18细胞增殖的作用；運用Western-blot检测SP18细胞中Wnt1、β-catenin与p-β-catenin蛋白的表达。结果 SP18-LMP1TRADD细胞的增殖能力较SP18-LMP1细胞减弱（P<0.01）；与SP18-LMP1细胞比较，SP18-LMP1TRADD细胞中Wnt1与β-catenin表达降低，而p-β-catenin蛋白表达增加（P<0.01）。结论 LMP1经Wnt1/β-catenin途径促进鼻咽癌干细胞SP18的增殖。

关键词：鼻咽癌干细胞；LMP1；Wnt1/β-catenin通路；细胞增殖

中图分类号：R318.0 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.024

文章编号：1006-1959（2018）07-0075-03

LMP1 through Wnt1/β-catenin Pathway to Promote the Proliferation of SP18 in Nasopharyngeal Carcinoma Stem Cells

ZHOU Ye，ZHANG He-liang，LIU Zhong-yuan，LUO Zhao-yang，ZHANG Zhi-wei

（ Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology，Institute of Oncology，School of Medicine，South China University，Hengyang， 421001，Hunan，China）

Abstract：Objective To investigate the mechanism of the carboxyl-terminal functional active region of LMP1 in promoting proliferation of nasopharyngeal carcinoma SP18 stem cells.Methods Growth curve，plate colony formation assay and soft agar colony assay were used to analyze the effect of LMP1TRADD on the proliferation of SP18 cells.The expression of Wnt1，β -catenin and p-β-catenin in SP18 cells was detected by Western-blot.Results The proliferative ability of SP18-LMP1TRADD cells was lower than that of SP18-LMP1 cells（P<0.01），compared with SP18-LMP1 cells， the expression of Wnt1 and β-catenin in SP18-LMP1TRADD cells decreased，while the expression of p-β-catenin protein increased（P<0.01）.Conclusion LMP1 can promote the proliferation of SP18 in nasopharyngeal carcinoma stem cells via Wnt1/β-catenin pathway.

Key words：Nasopharyngeal carcinoma stem cells；LMP1；Wnt1/β-catenin pathway；Cell proliferation

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国广东、广西、湖南和香港等南方地区最常见的头颈部恶性肿瘤。大量研究证实，EB病毒感染与NPC发病密切相关[1]。鼻咽癌干细胞在鼻咽癌转移、复发、放疗抵抗与耐药的发挥重要作用。潜伏性膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是EB病毒编码的重要致瘤蛋白之一[2-4]。LMP1羧基末端包括三个功能活化区（carboxy terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3[5-7]，其中CTAR2区域包含有肿瘤坏死因子受体相关死亡区（TRADD），是活性区重要的转化位点[7-9]。然而，LMP1表达对鼻咽癌干细胞生长增殖的影响及分子机制仍不十分清楚。

1材料与方法

1.1细胞与质粒 鼻咽癌干细胞SP18由中山大学肿瘤研究所建立并惠赠，细胞培养采用低血清（2%～5%）血清（购自杭州四季青公司）的RPMI1640（Gibco BRL公司）培养。逆病毒质粒pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD（LMP1的CTAR2区域TRADD突变）[5-7]由中南大学肿瘤研究所构建并惠赠。

1.2细胞生长曲线 取2×103个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板种中，每组均接种3个平行孔细胞，培养24 h后，每天2组取3孔细胞计数，重复计数3次，取均值为每组细胞数，连续计数细胞6 d，将所得不同时间计数细胞数连接后，绘制出细胞生长曲线。

1.3平板克隆形成实验 分别取300个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板中，每组均接种3个平行孔，将24孔板置于培养箱中培养2周后，观察细胞克隆形成情况，每孔加入1 ml甲醇进行细胞固定1 h后，加入0.5 ml的0.4%结晶紫染色15 min，肉眼计数细胞克隆，每孔重复计数3次，取3孔均值为每组克隆数，然后计算细胞克隆形成率，为形成克隆数比接种细胞数即为克隆形成率。

1.4软琼脂集落实验 用琼脂糖制备0.6%底层琼脂，冷却后用琼脂糖及细胞制备0.3%顶层琼脂（每孔含2×103个细胞）。实验设SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞组，每组3个平行孔，然后将24孔板置于37℃ 5% CO2温箱内培养2周后。观察集落形成情况并计数，其中细胞数大于50个细胞为1个集落，每孔重复计数3次，取3孔均值为每组集落数。计算细胞集落形成率为集落数比接种细胞数即为集落形成率。

1.5 Western-blot检测蛋白表达 收集细胞，提取细胞总蛋白，以30 μg总蛋白/泳道，进行10% SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭，一抗（1∶1000）室温孵育滤膜1 h，洗膜，HRP标记二抗（1∶1000）室温孵育滤膜1 h，洗膜后曝光、显影、定影，分析结果。

1.6统计学处理 采用SPSS22.0统计分析软件进行分析，计量资料数据用（x±s）表示，两组间均数比统计分析采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 LMP对SP18细胞生长的影响 将LMP1及LMP1TRADD导入SP18后，结果显示，SP18-LMP1细胞生长速度明显快于SP18-LMP1TRADD细胞的生长，说明LMP1可以促进SP18细胞的生长，而其CTAR2区域TRADD在促进SP18细胞生长中发挥重要作用（P<0.05），见图1。

注：#SP18-LMP1 vs. SP18-LMP1TRADD，P<0.05

图1 SP18-LMP1与SP18-LMP1TRADD细胞的生长曲线

2.2 LMP对SP18细胞增殖的影响 将LMP1及LMP1TRADD导入SP18后，结果显示，SP18-LMP1形成的细胞克隆与集落数量及体积均大于SP18-LMP1TRADD细胞，同样说明LMP1可以促进SP18细胞的增殖，而其CTAR2区域TRADD在促进SP18细胞增殖中发挥重要作用（n=3，P<0.05），见表1。

2.3 Western-blot检测NF-кB P65蛋白的表达 为了解LMP1的CTAR2区域TRADD促进SP18细胞增殖的作用机制，采用Western-blot检测LMP1对SP18細胞Wnt1通路的影响。结果显示，SP18-LMP1细胞中Wnt1与β-catenin蛋白的表达较SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表达低，说明LMP1活化Wnt1/β-catenin通路，而CTAR2区域TRADD是通路活化的重要部位。

注：1：SP18-LMP1细胞；2：SP18-LMP1TRADD细胞

图2 Western-blot检测Wnt1、β-catenin与

p-β-catenin蛋白的表达

3讨论

自Hamburger等[10]提出肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）以来，不同组织来源的TSC不断被分离，如乳腺癌[11]、肝癌[12]和肺癌[13]等。肿瘤组织TSC细胞数量少，其具有干细胞特性，被认为是恶性肿瘤发生和复发的根源。目前，鼻咽癌干细胞的生物学行为仍不清楚，其在NPC的作用及对转移、复发、耐药等的影响仍有待深入研究。EB病毒感染与NPC发生发展密切相关，在人体常潜伏感染，编码多种潜伏蛋白[2-4]。其中LMP1是EB病毒基因组编码促细胞癌变和转移作用的重要致瘤蛋白[5-7]。

LMP1蛋白作为EB病毒编码的重要致瘤蛋白，其在细胞功能的完成依赖于羧基端胞浆区的3个功能结构域，其中CTAR2（351～386aa）位于羧基端胞浆区末端，是羧基端重要的功能活性区域，能与TRADD蛋白结合，参与介导高水平NF- B及AP-1的活化[6-9]。本研究结果显示，将LMP1导入SP18细胞后，CTAR2的TRADD活性区LMP1突变体促SP18生长及增殖能力均明显低于野生型LMP1，说明LMP1-CTAR2的TRADD活性区参与了其促SP18细胞增殖的作用。

肿瘤干细胞中存在多条重要的信号途径，其中Wnt/β-catenin途径就是其中之一。细胞内Wnt途径包括两条，其一是决定细胞命运的经典通路，其二是控制细胞运动与组织极性的非经典通路[14]。Wnt经典途径参与细胞质内β-catenin稳定、其进行核转位，入核参与基因表达的调控。β-catenin游离于细胞质内并异常积聚，促进其入核。β-catenin量的蓄积、入核是Wnt/β-catenin信号途径活化的关键[15]。Wnt1/β-catenin通路的活化在肿瘤发生发展过程中具有十分明显的作用[16]。

本研究结果显示，SP18-LMP1细胞中Wnt1与β-catenin蛋白的表达较SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表达低，说明LMP1促进SP18细胞中Wnt1与β-catenin蛋白表达，且使β-catenin磷酸化抑制，导致细胞浆中游离β-catenin含量增加且入核量也上升，从而激活Wnt-1/β-catenin途径，从而发挥其促进SP18细胞增殖的作用，结果说明LMP1的CTAR2可能通过TRADD位点活化Wnt-1/β-catenin途径促进SP18细胞增殖，但如何发挥调节功能有待后续深入研究。

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收稿日期：2017-11-22；修回日期：2017-11-23

編辑/杨倩