山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响

林晓燕 孙晓红 张璐萍

【摘要】目的：研究山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）分别作用于胶质瘤U118细胞0h、24h、48h，分别采用CCK-8实验、划痕实验、Transwel1实验对细胞的增殖、迁移、侵袭能力进行检测。结果：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于胶质瘤U118细胞24小时和48小时均能显著降低细胞的增殖能力（P<0.05），且当山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于U118细胞48小时，增殖抑制率分别高达20.64%、47.61%、51.23%；划痕实验结果表明，不同浓度山慈菇水煎剂作用24小时及48小时均能明显降低胶质瘤U118细胞的迁移能力（P<0.05），且48小时药物降低细胞迁移的能力高于24小时；体外侵袭实验显示，山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）培养24h和48h均能明显的降低侵袭细胞数目，差异具有统计学意义（P<0.05）；结论：山慈菇水煎剂能够减轻U118胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，但对于其具体的机制还需要进一步的研究。

【关键词】山慈菇水煎剂；胶质瘤细胞；增殖；侵袭；迁移

胶质瘤是一种发病率高、致死率高的恶性脑肿瘤，5年内脑胶质瘤患者的生存率小于10%，该病多发于30岁至40岁的中年人群，其约占中年颅内肿瘤患者的1/3至2/3。胶质瘤侵袭性高，发病机制复杂，对于该疾病还没有完全根治的治疗方法[1]。目前，对于脑胶质瘤的治疗，临床上主要采用手术配合术后放化疗为主。放化疗不仅对肿瘤细胞存在杀伤力，对机体内正常的细胞也有很强的杀伤力[2]，副作用强，加重患者的不良反应，严重影响患者的生存质量及生活质量[3-5]。山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，有解毒消肿的功效，用于痈疽恶疮、淋巴结核和蛇虫咬伤的作用。现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭与转移、抗炎等作用。本课题采用山慈菇水煎剂作用于胶质瘤细胞，研究其对该细胞增殖、侵袭和迁移的影响，以期为脑胶质瘤靶向治疗药物的研究提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 药物及制备

U118胶质瘤细胞株由上海复旦大学细胞库提供，山慈菇购自北京同仁堂药店。电子精密天平秤取100g山慈菇藥材，根据传统中药煎煮方法进行煎煮。待液体至100mL附近时将其转移至高压灭菌后的烧杯中，并使用无菌培养皿将盛有煎剂的烧杯盖住，浓缩煎剂至50mL。于超净工作台中将水煎剂加入离心管（经高压灭菌处理）中，离心5min，转速为1000r.min-1，取上清。取5μL上清加入1mL无菌DMEM培养基中，置于3712，5%c02培养箱中放置48h，观察水煎剂是否染菌。剩余上清密封于4℃保存备用。48h培养后的上清置于显微镜下观察，确认无菌后，此次制备的水煎剂上清（2kg·L-1）原液即可用于后续的实验中。根据实验所需要的水煎剂浓度加入培养基，在超净台中，无菌条件下，稀释至研究所需要的浓度。

1.2 仪器与试剂

CCK-8试剂、碘化丙啶（PI）试剂、DMSO试剂、DAPI试剂、RNA酶、生理盐水和无水乙醇购于Sigma公司；胰蛋白酶购于Hyclone公司；胎牛血清（FetalBovine Serum，FBS）、DMEM高糖培养基购于美国Gibco公司；Transwell小室购于美国Coming公司；Matrigel基底膜购于美国BD公司；多功能酶标仪购于美国Mo-lecular Devices公司；倒置显微镜购于日本OLYMPUS公司，CO2培养箱购于德国BINDER公司；细胞培养箱购于美国Forma Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 人胶质瘤细胞培养

人胶质瘤U118细胞采用含10%FBS（已灭活）的高糖DIVIEM培养基培养细胞，将细胞置于3712、5%C02培养箱中培养，依据细胞具体生长状况，带其长满培养瓶70%～80%时对其进行传代处理，周期约为2天到3天，取对数生长期的细胞用于后续实验研究。

1.3.2 CCK-8实验

细胞增殖情况采用CCK-8方法进行检测。取对数生长期U118细胞，以1×104个细胞每孔接种于96孔板中，置于3712、5%CO2培养箱中过夜，待其贴壁后加入山慈菇水煎剂（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）培养24h：另外同样分组，山慈菇水煎剂（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）作用于细胞48h。待药物作用时间足够，弃去细胞培养液，PBS洗两遍，吸净PBS洗涤液，加入10μL CCK-8试剂，在细胞培养箱中孵育4h，450nm波长处酶标仪测定各孔光吸收值（OD值）。每组实验重复3次，记录数据用于后期统计。增值抑制率（%）=[（对照组OD值.加药组OD值）/对照组OD值]×100%。

1.3.3 划痕实验

将U118胶质瘤细胞接种于无菌6孔板中，每孔细胞数为2×106个，置于培养箱中，待过夜细胞贴壁后，使用200μL的枪头划出一条直的划痕，使用PBS将划下来的细胞洗涤干净，加入无血清DIVIEM培养基，分别加入山慈菇水煎剂（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）培养oh，24h，48h在显微镜下观察，并拍照记录，本实验重复三次，统计分析山慈菇水煎剂对U118细胞迁移的影响。

1.3.4 体外侵袭实验

在Trenswell小室（孔径8pm）上室的底膜表面铺上40μL Matrigel胶，稀释比例为1：3，37℃孵育0.5h。用无血清DMEM培养液稀释对数生长期U118细胞，上室中加入100μL细胞悬液，细胞数2×104个，Transwell小室下室中加入500μL DMEM（含10%FBS）培养液，恒温细胞培养箱培养过夜细胞贴壁后；分别加入山慈菇水煎剂（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）培养Oh，24h，48h，弃去上室培养液，加入甲醇固定0.5h，0.1%结晶紫染色20mln，在显微镜下观察，细胞计数，并拍照记录。实验重复3次，用于后期统计分析。

1.4 统计学方法

上述实验均需重复三次，实验获得的数据采用均数±标准差（'x±s）表示。数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，当P<0.05时，差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞增殖的影响

与对照组相比，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养24h后，U118细胞增殖抑制率分别为12.51%、12.72%、39.28%，24h山慈菇水煎剂作用后细胞的增殖抑制率均明显的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养48h后，U118细胞增殖抑制率分别为20.64%、47.61%、51.23%，48h山慈菇水煎剂作用后细胞的增殖抑制率均明显的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05），如图l所示。

2.2 山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞迁移的影响

对照组U118胶质瘤细胞培养24小时，细胞迁移至划痕的中间部分，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养24h后，相对划痕面积分别为41.12%，68.33%，78.32%，24h山慈菇水煎剂作用后细胞划痕面积均明显的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05）；对照组U118胶质瘤细胞培养48小时后，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养48h后，相对划痕面积分别为30.12%，42.20%，64.21%，48h山慈菇水煎剂作用后细胞划痕面积明显的高于对照组，差异显著具有统计学意义（P<0.05），如图2所示。

2.3 山慈菇水煎剂对U118胶质瘤细胞侵袭的影响

由表1可以看出，加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养24h后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养48h后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；此外，研究还发现，山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL作用于U118胶质瘤细胞48h侵袭数目明显的少于24h，差异具有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

中医中肿瘤主要归于“积聚”“痰核”范畴中，其发病可能与癌毒、痰凝、血瘀等相关。痰是构成肿瘤组织的有形成分之一，因其胶着黏腻之。山慈菇具有散结及化痰的作用，因此考虑其可能对于癌症具有治疗作用，且前期的多项研究表明，山慈菇具有抗肿瘤的药理作用，但是对于其具体的机制尚不明确[6]。

本研究结果显示，山慈菇水煎剂200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养24h后，U118细胞增殖抑制率分别为12.51%、12.72%、39.28%，其对细胞的增殖抑制率明显的高于对照组；培养48h后，加药组U118细胞增殖抑制率分别为20.64%、47.61%、51.23%，山慈菇水煎剂作用后细胞的增殖抑制率明显的高于药物作用24h时。加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养24h后，相对划痕面积分别为41.12%，68.33%，78.32%，細胞的迁移能力均明显的低于对照组：对照组U118胶质瘤细胞培养48小时后，相对划痕面积分别为30.12%，42.20%，64.21%，48h山慈菇水煎剂作用后细胞迁移能力均明显的低于细胞培养24h时。

加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养24h后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组：加入山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培养48h后，侵袭细胞数目均明显的少于对照组；此外，研究还发现，山慈菇水煎剂不同浓度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL作用于U118胶质瘤细胞48h侵袭数目明显的少于24h。

综上所述，山慈菇水煎剂200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL作用于胶质瘤细胞24小时和48小时均能降低细胞的增殖、侵袭和迁移能力，且随着作用时间的延长，药物浓度的增加，药物的抗增殖、侵袭和迁移的能力均增加，对于具体的机制，还需进一步的研究。

参考文献

[1]郭淳，龚永杰，孙放等.山慈菇水煎剂对人乳腺癌T-47D细胞增殖和迁移的影响[J].中医学报，2017，32（10）：1832—1835.