广东某地区猪丹毒杆菌的分离鉴定与药物敏感性分析

陆英杰，袁 生，邓玉妹，李君养，柯骏鸿，卢玉葵

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528231）

猪丹毒杆菌（Erysipelothrix rhuriopathiae）亦称猪丹毒丝菌或丹毒丝菌，革兰氏染色阳性，通常呈杆状，但在心内膜上分离到的病原菌菌体呈丝状，是一种人兽共患病原菌。该病原菌通常和猪瘟、猪肺疫形成三联苗在养猪业广泛应用，是养猪业有久远历史的重要病原菌。该病菌可以引起猪的急性和亚急性败血症、慢性心内膜炎和关节炎，也能引起人的类丹毒［1-2］。由于猪瘟-猪肺疫和猪丹毒三联苗的存在及抗生素的广泛应用，该病的防控获得很好效果，我国已将近20年未见有该病的发生和报道［3］。但近几年，猪丹毒旧病新发，在欧洲、日本和美国曾经暴发过，而且被分离鉴定的血清型也非常多［4］，与此同时在我国江苏、湖南、福建、云南等地也有该病暴发的报道，广东广州、佛山、清远等地的猪只也未能幸免，不仅造成幼龄猪只的急性死亡，同时成年猪只也出现急性和慢性猪丹毒特点，且死亡率不断升高，给广东地区养猪业造成严重的经济损失，同时由于耐药菌株的出现，为防治该病带来一定的困难［5］。尤其当该病出现，猪只将面临合并感染而死亡，对养猪业的潜在危害很大，因此预防并及时防控该病是保障养猪业顺利发展的关键。国内外目前集中于猪丹毒检测及耐药菌株基因的检测［6-7］及灭活苗或与其他病毒病联合疫苗的研究［8］，因此及早鉴定该类疾病，深入了解猪丹毒病原菌对猪只造成脏器损伤以及对药物的耐药性，及时控制本病的蔓延和侵害是防制和研究的重点。为此，本试验通过对广东地区发生的猪丹毒杆菌病猪进行病原的分离鉴定，获得广东地区流行的猪丹毒杆菌类型，经16S rRNA通用引物的基因序列鉴定确定其血清型，同时对SPF级BALB/c实验小鼠进行临床致病性实验，观察该病原菌对小鼠造成的病理损害，对机体免疫应答产生的结果，以了解该病原产生病理损伤的原因；药物敏感性实验确定其对哪些药物的敏感度比较强等，这些科学研究资料可以为进一步研究该病奠定基础，同时也为临床防治该病找寻合适的药物提供有价值的科研资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病料采自广东某地区疑似猪丹毒病猪的心、肝和肾等器官；实验动物SPF级BALB/c小鼠（25±0.1 g）购自广东医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0002。

主要试剂和仪器：PCR仪；16sRNA通用引物（上海生物工程科技有限公司）；多媒体图像分析仪（Image-proplus，Media Cybernetics 公司，2005）；IMark 680酶联免疫检测仪（BIORAD公司，2015） ；IgM和IgG酶联免疫检测试剂盒（南京建成工程研究所）；革兰氏染色液1套，血液培养琼脂（广东环凯生物科技有限公司）；药敏试纸片：青霉素G，链霉素，氨苄西林，头孢氨苄，头孢噻肟，林可霉素，头孢克肟，阿奇霉素，恩诺沙星（规格：10 μg/片，广州吉祥生物科技有限公司）

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离及形态学特性观察 参照文献［9］方法，将疑似猪丹毒杆菌的病猪进行心、肝、肾组织分离后在无菌条件下划线于血液琼脂平板和半固体培养基，将获得的菌落进行涂片染色镜检，记录细菌形态特征。保种，放于-20℃冰箱保存。

1.2.2 16S rRNA核苷酸序列鉴定及进化树分析 参照文献［10-11］使用能够扩增大多数细菌16 S rRNA 基因的通用引物，上游引物：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-ACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′，对所获的基因片段进行测序，将所获得序列进行Blast比对，并应用DNAstar软件的Multiple Sequence Aligment程序进行多序列比对和系统发育树构建。

1.2.3 动物感染试验 应用30只BALB/c小鼠进行感染试验，通过饮水口服方法对小鼠进行慢性感染，攻毒菌液浓度为107CFU/mL，观察小鼠临床变化，1周后眼球采血离心取血清置-20℃备用；处死并剖检感染小鼠观察肝脏和脾脏等的临床病理变化，同时采取小鼠的肝脏和脾脏进行中性甲醛固定，制作石蜡切片，H.E染色方法观察这些脏器的组织病理变化。

1.2.4 ELISA检测小鼠IgM和IgG抗体 应用ELISA检测试剂盒对试验小鼠进行血清中IgM和IgG的检测，方法参照试剂盒使用说明进行。

1.2.5 药敏性检测 采用药敏纸片扩散法，将通过细菌的表型特征观察以及引物扩增并测序比对后鉴定的5株菌进行血清肉汤培养，调整菌液浓度为107CFU/mL，然后将菌液均匀涂布在血液琼脂平板上，贴上药敏试纸片，37℃培养

24 h，测量抑菌圈大小并判定结果。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与16S rRNA的鉴定

临床诊断疑似猪丹毒杆菌的病猪的肝、肾和脾进行血液琼脂平板的分离培养鉴定，获得5株优势细菌，均形成针尖样大小的灰白色菌落，不溶血，革兰氏染色呈阳性杆菌，经过16S rRNA通用引物基因序列鉴定后确定均为猪丹毒杆菌，这5株菌分别命名为GZSs1、GZSq1、GZSs2、GZSj1、GGZSs。应用MEGA6软件分析5株菌与已报道的具有完全基因序列的两株猪丹毒杆菌GXBY-1和SY027两株菌进行亲源关系的分析。分离菌株16S rRNA的PCR产物电泳结果和基因进化树分别见图1和图2。

图1 分离菌株16S rRNA的PCR产物电泳结果

由图2可知，与已知GXBY-1和SY1027两个猪丹毒菌株相比，本研究分离获得的5株猪丹毒杆菌尽管在Blast比对中其亲源关系非常近，但它们在进化方面还是有明显不同，其中a株和c株菌两个进化关系相近，而d株与已知的GXBY-1株进化关系相近，b株和e株与其他菌株进化关系则有很大差异。

图2 5株分离菌与报道已知菌的基因进化关系树

2.2 ELISA检测小鼠血清中IgM和IgG的结果

对照组小鼠抗体IgM含量为30.63（±8.09）ng/mL，与攻毒组IgM含量（116.03±22.83 ng/mL）相比差异显著，对照组小鼠抗体IgG含量为21.11（±10.34）ng/mL，与攻毒组IgG含量（103.03±15.65 ng/mL）相比差异显著。显示口服致病小鼠尽管发病比较缓慢，但机体对病原刺激产生的抗体动力学规律是一样的。

2.3 感染小鼠肝脏和脾脏的病理变化

2.3.1 猪丹毒感染小鼠肝脏的病理变化结果 从图3（封三）可以看出，对照组肝脏的肝板结构整齐，胆管与血管集中地方界限清晰，肝细胞有代谢增生但没有空泡样变性和坏死；而感染组肝脏的肝板结构紊乱，肝细胞出现黄型的空泡样变性和坏死现象，肝细胞肿胀，核碎裂、核消失现象非常明显。

图3 猪丹毒感染小鼠肝脏的病理变化结果（H.E×400）

2.3.2 猪丹毒感染小鼠脾脏的病理变化结果 图4（封三）显示，对照组脾小体结构清楚，红髓和白髓间隙清晰可见，结构完整，无铁红素颗粒沉积；感染组脾小体结构紊乱，红白髓结构紊乱混杂，淋巴细胞出现变性坏死现象；而且有铁红素颗粒沉积，显示黑色颗粒堆积的地方均为沉积的铁红素颗粒。

图4 猪丹毒感染小鼠脾脏的病理变化结果（H.E×400）

2.4 药敏检测试验结果

9种药物对鉴定的5株菌药物敏感性试验结果见表1。从表1可以看出，a株、d株和e株菌对链霉素和林可霉素不敏感，对阿奇霉素和恩诺沙星中度敏感，对头孢克肟高度敏感，对青霉素和氨苄西林极度敏感；而b株和c株菌对林可霉素不敏感，对链霉素和恩诺沙星中度敏感，对青霉素、头孢氨苄、头孢噻肟和氨苄西林均极度敏感，但两株菌对阿奇霉素的表现不同，c株菌对阿奇霉素呈现极度敏感，对头孢克肟高度敏感；但b株菌对阿奇霉素表现中度敏感，对头孢克肟极度敏感。此种情况提示菌株对药物的抵抗性有一定的差异。

表1 5株菌药物敏感性试验结果（mm）

3 结论与讨论

3.1 猪丹毒杆菌对小鼠的感染

猪丹毒杆菌鉴定后，对SPF级小鼠进行口服感染，通过感染发现小鼠对猪丹毒杆菌的感染具有一定的抵抗力，口服7 d内与对照组相比，感染组进食较多和排泄粪便有细微的变化之外，其他并未出现明显的症状，口服7 d后处死小鼠，解剖发现心脏心肌变性，肝脏和脾脏有不同程度的坏死点和坏死区域，与临床上致死猪只的心脏和肝脏变化一致，证明该病菌的致病性。口服感染与报道中腹腔注射不相同［12］，口服易受到消化系统的影响，但该病原可通过消化道、呼吸道以及环境污染物引起易感动物感染，而且在啮齿类动物中也可分离到该菌，可见，小鼠既可以感染也可以是该病原的带菌传播者，感染的实验动物呈心内膜炎型［13］，而在实验中证实了这些观点，同时在剖检中发现小鼠肝脾也出现变性、坏死、充血、出血等问题，但小鼠在临床上并无典型症状表现，显示小鼠是养猪业猪丹毒杆菌的重要传播者，尤其是经口服感染的小鼠危害性可能更大。

3.2 猪丹毒对小鼠肝脾以及IgM和IgG的影响

通过小鼠致病性实验，观察到该病不仅对心脏造成坏死性影响，而且对肝脏和脾脏也造成损伤，经过病理观察显示该细菌肝脾造成的损伤，尤其是脾脏，它是免疫应答的场所，红髓和白髓的损伤会严重影响免疫细胞对免疫应答的产生，ELISA检测的IgM和IgG的浓度显示减少的B淋巴细胞参与体液免疫，而且脾脏红髓在病理观察中显示损伤严重。此外，致病性实验是通过口服进行的，猪丹毒杆菌虽然经过小鼠胃蛋白酶和酸性作用，但仍能刺激机体产生中和抗体，而且其动力学规律仍然符合初次免疫应答的规律，说明本试验获得的猪丹毒杆菌与文献中阐述的耐酸性能好是一致的，且有很强的致病性［14］。

3.3 猪丹毒对药物的敏感性

本试验获得5株猪丹毒杆菌，均来自于广东佛山某些地区。通过药敏片实验发现，这5株菌均对青霉素和氨苄西林极度敏感，对链霉素有不同反应；GZSs1、GZSj1、GGZSs这3株菌对链霉素不敏感，但GZSq1、GZSs2两株菌对链霉素表现中度敏感，该实验结果与20年前文献报道的MIC方法进行猪丹毒杆菌的药物敏感性实验具有一致性［15-16］，尽管MIC方法比药敏片方法更为准确但也显示出猪丹毒杆菌的进化对抗生素的敏感性。从本试验基因进化分析的图谱中发现，5株菌基因进化亲源性存在差异，暗示其对抗生素的敏感度会有所不同。在头孢噻肟、头孢克肟、林可霉素、阿奇霉素及恩诺沙星等抗生素的药物敏感性实验中，说明基因进化分析的可能，本试验发现5种菌株对头孢噻肟和恩诺沙星的重度和中度敏感与文献报道安徽菌株的药敏结果有所不同［11，16］，但对林可霉素的耐药性方面有一致的实验结果［5］。猪丹毒杆菌的耐药性不仅与基因进化有关，与生长环境等也有一定关系。

本试验通过分离培养和16sRNA基因序列鉴定获得5株猪丹毒杆菌，进化分析显示出同源性差异；对SPF级小鼠进行攻毒试验后，可以刺激机体产生IgM和IgG抗体，产生含量与空白对照差异显著；该菌严重损伤肝脏和脾脏，常规病理学变化显示肝脏和脾脏细胞均有不同程度的变性和坏死，脾脏红髓和白髓部分地方有铁红素沉积；药物敏感性试验证明5株菌对林可霉素均不敏感，部分对链霉素也不敏感；均对青霉素，氨苄西林和头孢噻肟极度敏感，对头孢氨苄重度敏感，阿奇霉素、恩诺沙星中度敏感显示临床上可以使用这两种药物进行治疗。

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