分子光谱分析原理在实践教学中的应用

邹文生，王亚琴，邵 群，赵东林，陈少华，冯绍杰

荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增，其原因在于荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、非侵入性和使用简便等优点，在现代分析与检测中发挥着日益重要的作用[1-3]。对于一个未来合格的科研工作者，了解荧光分析原理及应用显得十分必要。那么，如何在实际教学工作中向受教育者传授分子光谱分析原理，以什么样的传授方式最利于受教育者尽快地记住与掌握分子光谱知识是教学上应该解决的问题。牢记原理是关键，课前、课中与课后结合是手段，与实践相结合是法宝。

图1 光致发光过程的Jablonski能级图(左)与芘的激发与发射光谱(右)。字母S(Singlet State)与T(Triplet State)：分别为单重态与三重态的第一个字母。F(Fluorescence)与P(Phosphorescence)分别为荧光与磷光的第一个字母。S的下标0、1与2分别表示基态、第一激发单重态与第二激发单重态。Q(Quench)：猝灭。VR(Vibration Relaxation)：振动弛豫；IC(Inner Conversion)：内转换；ISC(Intersystem Conversion)：系间跨越。

1 荧光分析的基本概念与特征

1.1 光致发光过程的Jablonski能级图

光的发射过程与能量变迁紧密相连。图1-左是光致发光过程中光电子跃迁的能级变化。当没有外加能量时，分子中电子处在最稳定的状态—基态(S0)。当分子受光辐照后，外层光电子接收能量向高能级如S1或S2跃迁。处在激发态的电子不稳定，只能持续10-8秒量级的时间，然后返回基态。这时释放能量有三种方式：1)以光的形式释放，也就是荧光(F)；2)把能量传递给周边的分子，以释放热的形式返回基态；3)经过ISC到激发三重态如T1，再以光的形式释放，这就是磷光(P)，这个过程牵涉到电子的自旋状态的2次翻转，能持续微秒以上，甚至数十小时的时间。

1.2 荧光的激发及发射光谱(见图1-右)

激发光谱：不同激发波长得到固定发射波长的强度光谱；

发射光谱：同一激发波长得到不同发射波长的强度光谱。

1.3 荧光光谱基本特征(见图1-右)

1.3.1 Stokes位移

最大激发与发射间的波长差。电子的IC、VR等过程均会损失能量，造成发射光谱红移。这就如同从高空抛篮球，篮球的弹起高度总低于原始高度，因为空气摩擦与及与地面碰撞都会导致能量损失。如果激发与发射过程中能量损失的越小，那么Stokes位移值就越小；反之则越大。如果Stokes位移值越大的话，激发光对发射光的干扰越小，越有利于荧光在生物造影方面的应用。

1.3.2 激发与发射光谱呈镜像对称关系

理论上，如果没有能量损失的话，激发与发射光谱光谱呈现镜像对称关系。但由于能量损失总是不免发生与及荧光团所处化学微环境差异，导致光谱精细结构的消失而出现一定的偏差。芘是用于测量溶液极性的荧光探针，严格来讲，它的激发与发射光谱呈现指状峰特征，但由于化学微环境的差异，激发光谱的精细结构消失的更多，但尚能看出粗略的镜像关系。

1.3.3 发射光谱的形状与激发波长无关

在实践中就可以知道，用蓝于或红于最大激发波长的光去扫描发射波长，得到的光谱轮廓是一样的，只是强度上存在差异。同样的，激发光谱的形状与发射波长无关。正如图1-左所示，激发光谱与发射光谱的轮廓是一致的。

牢记上述的荧光分析的基本概念与特征，正确理解Jablonski能级图与荧光光谱基本特征，是学习与把握分子光谱分析的基础。

2 荧光分析法的教学组织与过程管理(见表1)

表1 荧光分析法的教学组织与过程管理

正确学习光谱分析法就必须把课前、课中与课后有机的结合起来。学生做好课前预习，做到对实验内容有一个大致的把握，同时，也可以发现对分子光谱分析理解不透彻的知识点，以备正式上课时提问，认真撰写荧光检测预习报告，做到脑海中有一个大致的实验操作雏形；在实验操作中，首先了解荧光分光光度计仪器原理及与紫外分光光度法的异同，听讲实验内容并认真浏览老师的实验演习，适当的挤出时间给学生提问，让学生做到对实验内容的完全把握。然后按预定小组内分工进行VB2的荧光检测实验，认真记录实验数据。实验最好交叉进行，让每个同学尽量接触到实验的每一个步骤，使同学们对实验内容由理论认识升华到感性认识。课中，抽时间检查学生预习报告，发现报告中存在的共同问题，实验结束后在课堂中细心讲解。实验结束后，讲解实验数据处理标准方法，课后完成实验报告撰写与课后练习题。整理实验器材，做到干净整洁，尽量维持与实验前一个样。批阅实验报告，根据实验报告的准确性与认真程度给予恰当的评定，对仍旧存在的问题，在网络平台及时与学生交流。

3 在科研过程中理解与升华分子光谱分析法

在科研中学习与巩固荧光分析法的基本内容，做到理论与实践结合。荧光分析法中荧光是一种检测信号，与其它的检测电、磁、质量与场等信号是一样的道理。只要被检测物的介入会导致荧光信号的衰减、增强与平移等，就能够实现被检测物的高灵敏检测；如果共存基质对被监测物的干扰小甚至没有，就能够实现对被检测物的选择性检测；在有干扰存在时，想办法掩蔽干扰物质以实现无繁冗预处理检测。

下面以近段时间以来本课题组导师制下学生参与的所发表的工作为例来阐述对荧光分析法的理解与深化。我们合成了一个柠檬酸与聚乙烯亚胺共碳化点[4]，并研究了它的光物理化学性能及传感潜力。图2-A是碳点的标准化激发与发射光谱，这两个光谱的对称关系较好，契合了分子光谱的镜像特征原理。拥有比传统染料更宽的Stokes位移，可有效减少散射光和激发光对发射光谱的影响，适合生物成像。插图显示此碳点有很高的荧光量子产率(～54%，硫酸喹啉作标准)。在生态pH值(7.4)下，该碳点在Zn2+存在下通过抑制光诱导电子路径增强荧光，在Cu2+或Co2+存在下通过内滤效应猝灭荧光，这意味着此碳点可以做光传感器探测环境中的上述三种离子(图2-B,C)。插图显示了不同离子存在下的碳点荧光成像，图片亮度差异明显，暗示了碳点对这些离子探测的高灵敏度。实验中我们发现离子对碳点作用的优先顺序：碳点对Cu2+或Co2+具有更强的络合能力。也就是说，当碳点被Zn2+增强后可以用作增强的光响应Cu2+或Co2+探针，这有利于探测灵敏度的提高。图2-D是将此探针应用于环境中实际水样品中Co2+检测。该碳点在0.012-12 μM内显示了一个宽的线性响应范围，线性回归方程为Y = 0.0423C + 0.04207(Y = log(F0/F)，F0、F与C分别为原始荧光强度、即时荧光强度与离子浓度)，R = 0.999，探测限为8.0nM，相对标准偏差(RSD)为5.7% (n = 5)。碳点展示了可忽略的细胞毒性、优秀的生物相容性与高光稳定性，并应用于细胞内离子的共聚焦成像与半定量检测。这些应用巩固了荧光分析法应用中的VB2检测内容，深化了荧光分析法的应用范围。

图2 柠檬酸与聚乙烯亚胺共碳化点的光物理化学性能(上)。碳点激发与发射光谱(A)，插图为碳点在365nm紫外灯照射下的荧光成像。Zn2+光响应增强碳点对Co2+的荧光滴定光谱(B)，插图1、2和3分别为碳点、Zn2+光响应增强碳点与加入Co2+后的荧光成像。常见离子对碳点的荧光响应(C)。Co2+滴定碳点的荧光光谱图(D)，插图为检测水中Co2+的标准工作曲线。碳点对Zn2+与Co2+荧光响应示意图与相应的Hela细胞成像应用(下)。

图3 间-溴苯酚杀虫剂基碳点制备并应用于图片打印与细胞成像(1)。Pb2+诱导的5-碘水杨酸晶状纳米粒子的无保护室温磷光(2)。荧光素异氰酸酯修饰的聚乙烯亚胺TNT荧光传感探针(3)。磁性荧光的TNT双识别探针(4)。

另外，我们也发展了其它的发光纳米材料并进行了广泛应用[5-8](图3)，进一步的加深对荧光分析法的理解，做到对荧光分析法的应用自如。比如，我们以杀虫剂间-溴苯酚为碳源制备了高亮碳点，并将其用作无色墨水打印图案(如安徽建筑大学徽派校门)与细胞成像。最可喜的是经过碳化以后，杀虫剂的毒性几乎没有了[5](图3-1)。另外，Pb2+诱导的5-碘水杨酸醇溶夜产生晶状纳米粒子，这种结构致密的粒子保护了5-碘水杨酸的激发三重态，从而观察到5-碘水杨酸的无保护室温磷光(图3-2)。我们也发展了荧光素异氰酸酯修饰的聚乙烯亚胺(图3-3)与Fe3O4磁性纳米粒子(图3-4)，构建了荧光猝灭与散射增强的TNT双识别探针。通过参与上述的科研活动，使学生熟练的掌握了荧光分析法原理，并拓宽了荧光分析法应用视野，为独立开展荧光分析方面的工作奠定了良好的基础。

4 总结

荧光分析是样品检测中常用的重要的方法之一。本文主要讲述了荧光分析的基本概念与特征，强调了学习过程中的课前、课中与课后结合的重要性，并用科研成果巩固荧光分析法的基本内容，显示荧光分析了荧光分析法在样品检测与分子识别领域的应用潜力。

[参 考 文 献]

[1] 许金钩，王尊本.荧光分析法(第三版)[M]. 北京：科学出版社. 2006.

[2] Joseph R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy (2ndEdition)[M]. Baltimore. 1998.

[3] 朱若华，晋卫军. 室温磷光分析法原理与应用[M]. 北京：科学出版社. 2006。

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[5] Zou, W.-S. Zou, F.-H. Shao, Q. Zhang, J. Wang, Y.-Q. Xie, F.-Z. Ding, Y. A selective fluorescent resonance energy transfer quenching and resonance light scattering enhancement dual-recognition probe for 2,4,6-trinitrotoluene[J]. J. Photochem. Photobio. A. 2014, 278: 82-88.

[6] Zou, W.-S. Wang, Y.-Q. Wang, F. Shao, Q. Zhang, J. Liu, J. Selective fluorescence response and magnetic separationprobe for 2,4,6-trinitrotoluene based on iron oxidemagnetic nanoparticles[J]. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405: 4905-4912.

[7] Zou, W.-S. Ji, Y.-J. Shao, Q. Xuan, H. Wang, X.-F. Wang, Y.-Q. Crystalline nanoparticles for self-protective room-temperaturephosphorescence based on synergism of multi-weak interactions in suspension solution[J]. Mater. Chem. Phys. 2016, 176: 121-128.

[8] Zou, W.-S. Ji, Y.-J. Wang, X.-F. Zhao, Q.-C. Zhang, J. Shao, Q. Liu, J. Wang, F. Wang. Y.-Q. Insecticide as a precursor to prepare highly bright carbon dots for patterns printing and bioimaging: A new pathway for making poison profitable[J]. Chem. Eng. J. 2016, 294: 323-332.