不同品种棉花与棉铃虫互作过程中的酶活力变化

张肖丽 ，张帅 ，雒珺瑜 ，张桂寅 ，崔金杰 *

（1.河北农业大学/教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北 保定071001；2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南安阳455000）

在受到植食性昆虫危害后，植物会产生一系列的防御反应以提高自身防御能力，进行自我保护，这种自我防御被称为植物的诱导抗性。植物的防御机制有多种如产生防御蛋白、有毒次生代谢物或诱导天敌的挥发性化合物。植物在漫长的进化过程中产生的次生代谢物能够在昆虫体内积累扰乱昆虫的消化系统、神经系统等从而影响昆虫的生长发育及繁殖能力[1]，影响昆虫体内解毒酶活力，干扰昆虫代谢活动，甚至导致昆虫死亡[2]，提高植株抗性[3]。比如，棉酚（文中简称“酚”）主要由棉花根部产生存储于根茎叶等组织中，是由异戊二烯单位重复组成的黄色二聚倍半萜烯类化合物，是棉花重要的抗生性次生代谢物[4]。在昆虫与植物互作过程中，昆虫也会增强自身的解毒能力，以应对植物的防御反应[5-6]。

过氧化物酶（Peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase，SOD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是棉花重要的防御酶，是植物在受到不良环境胁迫时进行代谢防御反应的关键酶[7]。POD、SOD与过氧化氢酶（Catalase，CAT）3种酶相互作用清除植物在受到环境胁迫时体内产生的过剩活性氧自由基 （Reactive oxygen species，ROS）[8]，使植物体内活性氧处于动态平衡状态以提高植物的抵御能力[9]。PPO是广泛分布于自然界各类植物体内的金属蛋白酶，属于抗氧化酶类[10]，不仅参与木质素的合成，还参与酚类物质氧化反应生成醌[11]。有研究表明，植物次生代谢物可诱导解毒酶活力产生变化[12]。酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）、谷胱甘肽-S转移酶 （Glutathione-S-transferase，GST）属于昆虫的主要解毒酶系。 乙酰胆碱酯酶（Acetyl cholinesterase，AChE）活力变化通常被用来反映昆虫对有机磷和氨基甲酸酯类农药的敏感程度，现有许多研究证实取食不同的寄主食物可以影响昆虫AChE酶活力[13]。

本文研究了棉铃虫幼虫取食诱导棉酚含量不同的棉花前后，棉花防御酶以及棉铃虫幼虫解毒酶、AChE酶活力的变化，以期为抗虫棉育种以及棉铃虫的综合治理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试棉花。供试棉花品种或品系 （以下统称“品种”）分别为鲁棉 12（低酚）、中棉所 22（低酚）、Giza77（低酚）、美 9101（高酚）、中棉所 12（高酚）、石远 321（高酚）、HG-BR-8（感虫对照），由中国农业科学院棉花研究所种质资源库提供。前6个品种棉籽的棉酚含量依次为0.008%、0.005%、0.023%、1.116%、1.005%、0.468%，各品种酚含量数据由种质资源库提供或参考文献所得[14-15]。各品种棉花种于光照培养室内种植，种植条件为温度（26±1）℃，相对湿度（75±5）%，光周期（光暗时间）14 h/10 h。

1.1.2供试昆虫。供试棉铃虫虫卵购于济源白云实业有限公司。于人工气候培养箱内孵化，孵化条件为温度（28±1） ℃，相对湿度（75±5）%，光周期（光暗时间）14 h/10 h。

1.2 试验方法

1.2.1棉铃虫幼虫取食诱导。（1）幼虫质量测定试验。待棉花长至6～8叶期，取棉花顶部展开的倒三叶接入棉铃虫初孵幼虫5头，以微型养虫笼固定，3 d后称量棉铃虫幼虫质量。（2）室内抗虫性鉴定。取棉花顶部展开的倒三叶插入加有琼脂的塑料杯内，接入初孵棉铃虫幼虫5头，并封口防止其逃逸。每个品种随机取10株，设3次重复。5 d后调查计算各品种棉铃虫幼虫校正死亡率（rA）及叶片被害级别（DL）。公式：rA（%）=（ri－rCK）/（ 1－rCK）×100。式中，ri为某鉴定材料的棉铃虫幼虫死亡率，rCK为对照材料的幼虫死亡率。DL=（∑i×Ni）/N。 式中，i为叶片某被害级别，Ni为i级别叶片数，N为调查叶片总数。

具体评判标准参照雒珺瑜等方法[16]。将目测叶片被害级别分为4个等级，根据叶片被取食程度依次为：1级―受害成针眼状且不连片；2级―受害呈片状，小于叶面积的25%；3级―受害呈片状，受害面积在≥25%～＜50%；4级及以上―受害呈片状，受害面积≥50%。室内抗性鉴定综合评定时取各指标最低值，抗性级别标准为：高抗，幼虫校正死亡率≥90%，叶片被害级别为1级；抗，幼虫校正死亡率在≥60%～＜90%，叶片被害级别为2级；中抗，幼虫校正死亡率在≥40%～＜60%，叶片被害级别为3级；感及以下，幼虫校正死亡率小于40%，叶片被害级别为4级及以上。

1.2.2各品种棉花保护酶活力测定。选取长势相同的同时期各品种棉花顶部倒三叶接入初孵棉铃虫幼虫5头，用微型养虫笼固定，待取食0 h、24 h、48 h、72 h后收取这些棉叶，液氮速冻，－80℃保存待用。

棉花POD酶活力测定采用POD测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），测定470 nm处的吸光度的变化值。棉花SOD酶活力测定采用SOD测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），利用SOD专一性抑制超氧离子自由基的原理，以分光光度计测其吸光度值来计算。棉花PPO酶活力选用PPO测试试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定，以分光光度计测定420 nm处的吸光度值变化来计算。棉花POD酶活力以每克新鲜棉叶在1 mL反应体系中470 nm处的吸光度0.01为1个酶活力单位（U）。棉花PPO酶活力单位定义为每分钟每克新鲜棉叶在1 mL反应体系中420 nm处的吸光度值变化0.01为1个酶活力单位（U）。SOD以反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为1个酶活力单位（U）。计算方式见说明书[17-19]。

1.2.3棉铃虫解毒酶及AChE酶活力测定。选取长势相同的同时期各品种棉花，在顶部倒三叶接入初孵棉铃虫幼虫5头，用微型养虫笼固定。待取食24 h、48 h、72 h后收取棉铃虫幼虫样品，液氮速冻后－80℃保存。棉铃虫幼虫ACP、GST与AChE 3种酶活力均采用酶活力测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。

ACP酶活力单位（金氏单位）定义：37℃下每克组织蛋白与基质反应30 min产生1 mg酚为1个金氏单位。GST酶活力单位定义：37℃下1 mg组织蛋白扣除非酶促反应，使反应体系中非还原性谷胱甘肽浓度降低 1 μmol·L－1为 1个酶活力单位。AChE酶活力单位定义：1 mg组织蛋白37℃保温6 min后，使反应体系中1 μmol基质水解为1个酶活力单位。计算方式见说明书[20-22]。

1.2.4数据处理。数据处理采用SPSS 20进行单因素方差分析判断差异显著性，以Turkey HSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 抗虫性鉴定结果

接虫3 d后，取食不同棉酚含量品种棉花叶片的棉铃虫幼虫质量为取食低酚棉＞取食高酚棉，但差异未达显著水平。取食高酚品种美9101棉花叶片的棉铃虫幼虫质量较取食低酚品种鲁棉12、Giza77、中棉所22的幼虫质量分别低3.35%、0.69%、2.03%。取食高酚品种石远321的棉铃虫幼虫质量分别较取食低酚品种鲁棉12、Giza77、中棉所 22的低 3.52%、0.87% 、2.2%（表 1）。

室内叶片接虫5 d时的抗性鉴定结果显示：取食鲁棉12的棉铃虫幼虫校正死亡率最高，取食中棉所12的棉铃虫幼虫校正死亡率最低，但各品种之间无显著差异。中棉所12叶片被害级别最高，与鲁棉12、Giza77有显著差异（表1）。各品种棉花对棉铃虫抗性水平均为感虫。

表1 棉花抗虫性鉴定结果

2.2 棉花防御酶活力比较

棉铃虫取食前各品种棉花叶片防御酶活力比较结果显示：美9101的POD酶活力最低，Giza77最高；PPO酶活力最低的是中棉所12，最高的是鲁棉12；SOD酶活力最低的是鲁棉12，最高的是中棉所22（表2）。棉铃虫幼虫取食前各品种间棉花防御酶活力有差异，且部分差异达显著水平，但此时防御酶的活力与棉酚含量无相关性。

棉铃虫幼虫取食后各品种棉花叶片POD酶活力均随着取食时间的增加逐渐升高，且除鲁棉12以外的低酚棉品种POD酶活力增幅较高酚棉品种小。棉铃虫幼虫取食24 h时，美9101、中棉所12、石远321叶片PPO酶活力显著升高，而鲁棉12、Giza77、中棉所22无显著变化；取食48 h时，美9101、中棉所12叶片PPO酶活力低于鲁棉12、中棉所22、Giza77，但差异均不显著。除中棉所22外，其余各品种棉花叶片SOD酶活力在棉铃虫幼虫取食诱导48h时均较取食0h、24h时显著增高（表2）。

表2 棉铃虫幼虫取食不同时间后各品种棉花防御酶活力

2.3 棉铃虫幼虫解毒酶及AChE酶活力比较

测定结果（表3）显示：在取食各品种棉花24～48 h时，棉铃虫幼虫AChE酶活力显著降低；48 h时，取食高酚品种美9101、中棉所12的棉铃虫幼虫AChE酶活力显著高于取食各低酚品种的，但取食石远321的棉铃虫幼虫AChE酶活力仅显著高于取食鲁棉12的。取食各品种棉花后，几乎所有棉铃虫幼虫ACP酶活力在取食24～48 h时变化不显著，但在取食72 h时，取食鲁棉12、Giza77、中棉所22、美9101、石远321的棉铃虫幼虫ACP酶活力均显著增高。在取食24～48 h时，取食高酚品种美9101、中棉所12、石远321的棉铃虫幼虫GST酶活力均显著增高，而低酚品种间并未呈现一致的增高或下降趋势。

表3 取食不同品种棉花后棉铃虫幼虫体内酶活力变化

3 结论与讨论

植物在受到病虫害、旱涝、盐碱等胁迫时，会诱导或抑制植物次生代谢物质的合成从而提高植物的自我防御以及适应不良环境的能力[23]。在受到蚜虫危害后，抗性棉花品种苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、POD 和 PPO 酶活力均显著高于感虫品种，PPO的活力变化与棉花的抗蚜性强弱相关[24]。任茂琼等研究发现朱砂叶螨取食玉米的抗性越强体内解毒酶活力越高[6]。毛红等研究发现绿盲蝽危害后棉花PPO酶活力升高，且抗性品种PPO酶活力上升速率要高于感虫品种[25]。曾永三等研究发现棉花防御酶中PPO酶活力的增加可以促使植物体内酚类合成与木质素的积累来抵御锈菌，POD通过参与植物木质素的合成，增加细胞壁木质化程度来增加植株抗性[26]。SOD是植物在逆境下体内活性氧清除过程中的重要抗氧化酶，SOD酶活力与植物的抗逆性成正相关[27]。

本研究通过分析不同品种棉花受到棉铃虫幼虫取食危害前后SOD、PPO、POD酶活力的变化来判定不同棉花品种诱导抗性的强弱。本试验中不同品种棉花中酶活力在受危害之前存在明显差异，且与棉酚含量不相关；但是在受到棉铃虫危害后，不同棉酚含量的棉花叶片POD酶活力均显著增高，且多数低酚品种POD酶活力增幅较高酚品种小。高酚品种在受棉铃虫胁迫后，棉花叶片PPO酶活力在24 h内显著增高，低酚品种在48 h内PPO酶活力也上升但不显著。棉铃虫持续取食48 h后各品种SOD酶活力均升高，取食72 h时较取食48 h增加或下降。受棉铃虫危害后，棉花通过防御酶活力的变化一定程度上提高了棉花的抗性水平，其中高酚棉花品种PPO、POD酶活力变化受棉铃虫胁迫影响较大，也反映了高酚品种诱导抗性水平高于低酚品种。

植物与昆虫之间的互作是1种防御与反防御的过程。植物次生物质既可以毒杀昆虫，也可以诱导昆虫通过调控解毒酶以及AChE酶活力以提高其适应能力[28-30]。李时荣等研究发现解毒酶促进了麦长管蚜对不同品种寄主的适应性[31]。本试验中，棉铃虫幼虫AChE酶活力在一定时间内随着取食时间呈降低趋势，且与酚含量相关。除取食中棉所12以外的棉铃虫幼虫ACP酶活力在取食72 h时均显著增高，但其变化趋势与酚含量之间无关。取食高酚品种的棉铃虫幼虫GST酶活力在取食48 h时较取食24 h时显著增高，取食低酚品种棉花的棉铃虫幼虫GST酶活力变化趋势不一致。

本试验中对不同品种棉花的室内生物学抗性测定结果表明，在饲喂条件相同的情况下，取食不同品种棉花的棉铃虫3 d龄幼虫质量无明显差异。这可能与所选棉花品种棉铃虫抗性一致有关。棉铃虫幼虫取食后的棉花防御酶的活力测定结果显示不同棉酚含量品种棉花在受到棉铃虫危害后POD、PPO酶活力的变化不仅与受害时间有关，且受棉酚含量的高低影响。取食不同棉花品种后的棉铃虫幼虫AChE、GST酶活力的变化表明昆虫解毒酶活力变化与取食棉花的酚含量相关。综上所述，棉花防御酶、棉铃虫解毒酶及乙酰胆碱酯酶活力变化受棉花品种酚含量高低、棉铃虫危害时间等因素综合影响，低酚品种诱导抗性低于高酚品种。

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