哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展

陆陈晨 谭树华

摘 要： 哺乳動物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。

关键词： 哺乳动物细胞；驯化；无血清培养

重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。

1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点

传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]：

1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化；

1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性；

1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。

2 细胞无血清悬浮培养的优势

细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。

3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法

3.1 分子生物学手段改造

贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表达。这种被称为Super CHOr的细胞系接种到微载体或以悬浮方式培养时，通过异丙基-D 硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导，可以在无外源蛋白添加的培养基中以 20-24 小时倍增速度自分泌生长，改造后的悬浮细胞适用于生产重组蛋白。

3.2 降低培养基血清含量

另一种常用的贴壁细胞驯化方法是逐步降低培养基血清含量，细胞适应后最后换成无血清培养基培养[4]。杨栋，牛红军等人采用逐步降低血清法将表达 rHuEPO 的贴壁 CHO-EPO 工程细胞株驯化成悬浮细胞，摇瓶培养，最终接种至生物反应器放大培养，具体通过每 2 天弃去贴壁培养的 CHO-EPO 方瓶中一半旧培养基，加入等量的无血清基础培养基 B001，培养基中血清浓度依次以5%，2.5%，1.25%，0.625% 降低。当血清浓度降至 1% 以下，完全以基础培养基 B001 继续培养，即得悬浮 CHO-EPO 细胞[5]。

4 展望

无血清悬浮培养的哺乳动物细胞相比贴壁细胞既可提高细胞的培养密度，黄锭，赵亮，谭文松等人在犬肾细胞MDCK驯化时研究发现MDCK细胞悬浮生长时细胞延滞期缩短，细胞生长速度增快，活细胞密度和细胞活力提高，葡萄糖比消耗速率、乳酸和氨的比生成速率都大幅降低，而乳酸对葡萄糖的转化率有所升高[6]。同时也消除了血清中动物源性成分对重组蛋白表达的影响，由于杂蛋白较少，也便于后续纯化，更有利于大规模工业化生产。另外，不同的重组蛋白工程细胞悬浮培养时可能适用于不同类型的无血清培养基，通过对培养基优化筛选可使悬浮细胞在最优的条件下生长和表达重组蛋白。

参考文献

[1] Jayapal KP， Wlaschin KF， Hu WS ， Yap HGS .Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting， Chem Eng Prog[J]，103：2007（40-47）.

[2] Wurm FM .Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells， Nat Biotechnol[J]， 22：2004（1393 -1398）.

[3] S.C.O. Pak， S.M.N. Hunt， M.W. Bridges， M.J. Sleigh & EE Gray，Super-CHO-A cell line capable of autocrine growth under fully defined protein-free conditions， Cytotechnology[J]， 1996， 22：（139-146）.

[4] Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono， Sybille Hunt， Charles Bailey， Masood Baig， Merilyn Sleigh & Peter Gray Regulated autocrine growth of CHO cells， Cytotechnology[J]， 2000， 34：（39–46）.

[5] YANG Dong， NIU Hong-jun， LU Gang， SHI Jia-lin， SUN Hao-ming， LI Hui* An Optimized Method for Suspension Culture of CHO Cells to Produce Recombinant Human Erythropoietin （EPO）， Progress in Modern Biomedicine[J]， （2012）， 26-5053-04.

[6] Ding Huang， Liang Zhao， and Wensong Tan Adherent and single-cell suspension culture of Madin-Darby canine kidney cells in serum-free medium， Chinese Journal of Biotechnology[J]， 2011， 27（4）： 645？652.