黄诺玛苷对高糖诱导HUVEC细胞氧化应激及VEGF和ICAM—1蛋白表达的影响

王丽丽 李琳琳 张楠楠 王烨 骆新 陶义存 毛新民

[摘要] 目的 觀察两色金鸡菊黄酮类化合物黄诺玛苷对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化应激及血管内皮生长因子（VEGF）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）蛋白表达的影响。 方法 将HUVEC细胞分为正常对照组（NG）、高糖模型组（HG）及不同浓度黄诺玛苷组（50、100、200、400 μmol/L）。酶联免疫吸附测定法（ELASA）检测细胞上清液中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。用Western blot方法检测细胞中VEGF和ICAM-1蛋白表达水平。 结果 与NG组比较，HG组MDA明显升高，SOD、CAT、GSH-Px明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。与HG组比较，黄诺玛苷干预后，MDA含量显著降低（P < 0.05），SOD、CAT、GSH-Px活力显著上升（P < 0.05）。Western blot结果显示，与NG组比较，HG组VEGF和ICAM-1蛋白表达量增多（P < 0.05或P < 0.01）。与HG组比较，黄诺玛苷干预后VEGF和ICAM-1蛋白表达量随浓度递增而依次减少（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 黄诺玛苷可能通过改善氧化应激水平和下调VEGF、ICAM-1的表达对高糖诱导HUVEC损伤具有一定保护作用。

[关键词] 黄诺玛苷；人脐静脉内皮细胞；氧化应激；血管内皮生长因子；细胞间黏附分子-1

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（a）-0008-05

[Abstract] Objective To observe the effects of flavanomarein glycosides of Coreopsis tinctoria Nutt. on oxidative stress and expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1） protein in human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） induced by high glucose. Methods The cultured HUVEC cells were divided into normal control group （NG group）， high glucose model group （HG group） and different concentrations of flavanomarein group （50， 100， 200， 400 μmol/L）. The activity of malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GSH-Px） in supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELASA）. The expression levels of VEGF and ICAM-1 protein in cells were detected by Western blot method. Results Compared with NG group， the content of MDA in HG group was significantly increased， the levels of SOD， CAT and GSH-Px in HG group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with HG group， after flavanomarein intervention， the content of MDA in HG group was significantly decreased， CAT， GSH-Px activity increased significantly （P < 0.05）. The results of Western blot showed that compared with NG group， the expression of VEGF and ICAM-1 protein in HG group increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with HG group， after flavanomarein intervention， the expression of VEGF and ICAM-1 protein increased with the increase of concentration followed by reduction （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Flavanomarein has a protective effect on HUVEC induced by high glucose may be through improving the level of oxidative stress and decreasing the levels of VEGF and ICAM-1.

[Key words] Flavanomarein glycosides； Human umbilical vein endothelial cells； Oxidative stress； Vascular endothelial growth factor； Intercellular cell adhesion molecule-1

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是微血管并发症之一，可造成不可逆转的视力丧失，其发病机制复杂[1]。氧化应激（OS）与DR的发生发展存在关联性。高血糖会在一定程度上导致体内的氧化应激反应，而氧化应激通过对内皮细胞及线粒体的损害，造成代谢通路异常，加重炎性反应[2]。研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）和细胞间黏附分子1（ICAM-1）与DR的发生、发展密切相关，其介导的新生血管生成及炎性反应在DR的发生发展中起重要作用，抑制血管内皮细胞VEGF和ICAM-1失衡是DR防治的重要靶方向[3]。两色金鸡菊Coreopsis tinctoria Nutt.具有清热、活血健脾的功效[4]。本课题组前期研究发现，其提取物对实验动物血糖、血脂、血压异常均有一定影响，并显著降低糖尿病大鼠视网膜相关炎症因子的表达，黄诺玛苷为其重要的活性成分之一[5-11]。本研究通过观察黄诺玛苷对高糖诱导损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的氧化应激指标及VEGF和ICAM-1表达的影响，探讨其对HUVEC的保护作用，为黄诺玛苷治疗DR提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验对象 人脐静脉内皮细胞（HUVEC），由新疆医科大学中心实验室提供。

1.1.2 主要试剂 黄诺玛苷（ChromDex有限公司，加拿大，批号：ZES-0058S）；CCK8（日本同仁，批号：CK04）；DMEM培养基（Hyclon公司，批号：SH30022.01）；葡萄糖（Sigma公司，批号：G7528）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）酶联免疫试剂盒（上海钰博生物科技有限公司，批号：E20170916A）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo公司，批号：23227）；VEGFA抗体（abcam公司，批号：ab46154）；ICAM-1抗体（proteintech公司，批号10831-1-AP）；β-actin抗体（博奥森，bs-0061R）；磷酸酶标记二抗（北京博奥森，批号：AF01201181）；AP显色液（Invitrogen，批号：WP20001）；凝胶制备试剂盒（北京索莱宝公司，批号：20170207）；PVDF膜（Millipore，批号：IPVH00010）；脱脂奶粉（BD，LOT：4143845）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将HUVEC细胞分为正常对照组（NG组）、高糖模型组（HG组）及不同浓度黄诺玛苷组（50、100、200、400 μmol/L）。NG组：正常细胞+DMEM低糖培养基（5.56 mmol/L葡萄糖）。HG组：正常细胞+DMEM高糖培养基（50 mmol/L葡萄糖）。50、100、200、400 μmol/L黄诺玛苷组：正常细胞+50 μmol/L黄诺玛苷+DMEM高糖培养基（50 mmol/L葡萄糖）；正常细胞+100 μmol/L黄诺玛苷+DMEM高糖培养基（50 mmol/L葡萄糖）；正常细胞+200 μmol/L黄诺玛苷+DMEM高糖培养基（50 mmol/L葡萄糖）；正常细胞+400 μmol/L黄诺玛苷+DMEM高糖培养基（50 mmol/L葡萄糖）。

1.2.2 CCK-8检测细胞活性 将处于对数生长期细胞接种在96孔板中，浓度调整为5×104个/mL，加细胞悬液100 μL/孔，设5个复孔。细胞贴壁后，按上述分组，给予100 μL各浓度无血清含药培养液，培养24 h，每孔加CCK-8 10 L，孵育2 h。450 nm处测吸光度值。

1.2.3 细胞上清液中MDA、SOD、CAT、GSH-Px测定 接种细胞（密度为5×104个/孔）于96孔板中，药物干预按“1.2.1”分组进行，每组5个复孔。孵育24 h后，收集上清液，检测上清液中MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力。

1.2.4 Western blot检测VEGF、ICAM-1蛋白表达水平 将细胞接种于10 cm的细胞培养皿中，按分组给予无血清含药培养液，孵育24 h，提蛋白，测含量。跑胶、电泳1.5 h，转膜2.5 h，封闭1.5 h，一抗4℃过夜，二抗孵育2 h，显色、凝胶图像分析软件对结果进行灰度分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8检测结果

与NG组比较，HG组细胞活力明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与HG组比较，黄诺玛苷（50、100、200、400 μmol/L）组细胞活力均明显升高，差异有统高度计学意义（P < 0.01）。见图1。

2.2 黄诺玛苷对高糖诱导HUVEC细胞损伤MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活力的影響

与NG组比较，HG组中MDA明显升高（P < 0.01），SOD、CAT、GSH-Px活力明显降低（P < 0.05或P < 0.01）；与HG组比较，黄诺玛苷干预后上清液中MDA含量显著降低（P < 0.05），SOD、CAT、GSH-Px活力显著上升（P < 0.05）。见表1。

2.3 黄诺玛苷对HUVEC细胞VEGF和ICAM-1蛋白表达的影响

2.3.1 黄诺玛苷对HUVEC细胞VEGF蛋白表达的影响 与NG组比较，HG组VEGF蛋白相对表达量增加（P < 0.05）。与HG组比较，50 μmol/L黄诺玛苷组蛋白表达量降低，但差异无统计学意义（P > 0.05）；100、200、400 μmol/L黄诺玛苷组蛋白相对表达量降低，且差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图2。