草莓镶脉病毒的分子检测

张婷，陈妤，王文银，李雪雁，马建忠

兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050

在农业生产中，一些农作物经过几代种植，品质一般都同现不同程度的退化，在马铃薯、蔬菜、果树、花卉等农作物上表现得尤为突出。根据科学家的长期研究，农作物品质衰退的原因主要是植物病毒的感染。为获得高产，生产中就必须培养出无病毒苗，即脱毒苗。

草莓种植随着设施栽培年限的延长，以红中柱根腐病、黄萎病、枯萎病为代表的土传病害发生频率增加，土壤连作障碍也成为制约产业健康发展的瓶颈因子。草莓长期使用无性繁殖种苗由于繁殖代数多，易使品种退化，叶子皱缩，生长缓慢，果实逐年变小、畸形率高、品质差，并逐年加重！另外长期匍匐茎繁殖难免会传染一些土传病，病毒感染严重，抗病力减弱，产量、质量，效益锐减。

植物组织培养脱毒技术是草莓脱除病毒病的一种最有效的途径之一。通过植物组织培养技术进行草莓的脱毒与试管苗繁殖，缩短了草莓繁殖周期，去除体内积累的病毒含量，保持亲本的优良性状，提高了繁育能力和繁殖系数。

草莓镶脉病毒（SVBV）是侵染草莓的主要病毒之一。虽然SVBV 侵染草莓的形态特征并无十分明显的改变，但仍可导致草莓匍匐茎数量减少，草莓植株生长衰弱，果实产量及品质均下降等危害。农业生产上为保持草莓品种的优良性状，通常采用无性繁殖途径培养种苗，这使得病毒不断积累、传播。有研究表明，病毒病造成草莓每年减产达30%～80%。对草莓病毒病的防治，一是培育脱毒苗，二是建立严格有效的病毒检测程序。本论文所分析的草莓样品主要为本实验室收集的品种和多次赴甘肃省永靖县草莓种植地采集的植株和叶片样品。其中，一些样品表现出明显的生长不正常形态。比如：叶面不规则黄化成斑驳状、植株矮化匍匐茎减少、叶面不规则坏死成枯斑、叶片边缘有红褐色、叶片褪绿黄化及叶片皱缩不平整等。

1. 材料与方法

1.1 材料

含镶脉病毒草莓样品取自甘肃省临夏市永靖县，阳性对照为兰州理工大学马建忠实验室收集的草莓镶脉病毒感染品种，大肠杆菌（Escherichia coli DH5α）同为本实验室收藏。

主要的分子生物学试剂：10×PCR缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.3，500 mM KCl，15 mM MgCl2）、DNA分子量标志（DL 2000）、T4 DNA连接酶、10×T4 DNA 连接酶缓冲液（500mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.8，100 mM MgCl2，10mM ATP，100 mM DTT）、RNase A、dNTP 混合液（25 mM dATP，25 mM dTTP，25 mM dCTP，25 mM dGTP）、rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）、pMD19（simple）T载体、6×上样缓冲液（30mM EDTA，36% (V/V)Glycerol，0.05% (W/V) Xylene Cyanol FF，0.05% (W/V) Bromophenol Blue）等。所用酶制剂主要购自生工生物工程（上海）有限公司。

主要仪器：移液器、PCR仪、电泳系统、紫外分光光度计、电热压力灭菌锅、振荡培养箱、生化培养箱、台式高速离心机、透射紫外观察仪、低温冰箱、水浴锅、数码相机等。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集

除本实验室收集的草莓品种外，赴永靖县草莓种植地采集生长状况正常和具有SVBV病毒侵染症状的草莓植株或叶片。将获得的三株疑似含SVBV病毒草莓样品命名为L1、L2、L3。

1.2.2 引物设计

从NCBI数据库提取SVBV核苷酸序列资料，用Oligo 7软件设计了数对SVBV保守区的特异性PCR引物，交由生工公司（上海）合成。这对引物的核苷酸序列如下，上游引物（F1）：5' - CTAACTATCTTACACAGGGAAC；下游引物（R1）：5' -GTCCGATCTCATTACAAATCCA。

1.2.3 SVBV的PCR扩增

以改良CTAB法提取样品中的总DNA作为PCR的模板，分别用 引 物F1、R1进 行 PCR扩增。PCR扩增程序：94℃预变性90sec；之后执行30个循环，每个循环为94℃变性30sec、45℃退火30 sec、72℃延伸30 sec；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL产物加入1μL 6×上样缓冲液，上样于1.2%琼脂糖凝胶，100V电压下电泳30～40min，之后置疑胶成像系统拍照。

2. 结果与分析

2.1 草莓镶脉病毒感染样品与脱毒苗总DNA PCR扩增电泳结果

图1： 疑似含草莓镶脉病毒样品DNA检测与采得的疑似含草莓镶脉病毒样品DNA检测

A：草莓镶脉病毒感染样品与脱毒苗总DNA PCR扩增电泳结果。DL 2000分子标志；1：阳性对照（草莓镶脉病毒感染样品基因组PCR电泳结果）；2：脱毒苗基因组PCR电泳结果。

B：采得的疑似含草莓镶脉病毒样品DNA检测。 M：DL 2000分子标志；1～3：获得的三株疑似含草莓镶脉病毒样品，分别为L1、L2、L3。

经PCR扩增，1.2 %琼脂糖凝胶电泳后，样品L1、L2、L3得到了专一的扩增产物带，带的大小与预期大小（618bp）完全一致。据此初步判断，三个来自永靖县的草莓样品种（L1、L2、L3）带有SVBV。

经实验证明，所设计引物F1、R1可以专一性检测出草莓SVBV病毒，建立了快速有效的草莓镶脉病毒检测方法。从而诱导脱毒苗，繁育无毒品种，提高果实品质及产量。草莓脱毒苗具有产量高：每株开花数多，花序数、坐果率平均增加50%左右；果形好：果子外观好，色泽鲜红，均匀整齐，果子大，无畸形果；

果期长：边成熟边开花，经久不衰。结果期一般延长20-25天，有利于分批上市，减少积压损失；生长快：脱毒苗生长快，长势旺，茎叶粗壮，繁殖系数高，推广速度快；繁育力强：草莓脱毒苗结果后还可繁殖出20-50倍以上的种苗，供大面积应用或出售；效益高：草莓脱毒苗在生产上极明显的增产效益可连续保持三年以上，可繁殖出大量脱毒一代，二代和三代苗，因此是一年投资、多年受益等特点，本实验对于草莓SVBV病毒脱毒苗的培育具有重要的理论意义和生产指导意义。