一株苏云金芽孢杆菌自然突变体活性丧失的研究

魏敏

摘要：通过对一株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）自然突变体cry1C基因的克隆和测序，分析突变位点对该基因所表达蛋白质结构的影响及活性丧失的原因。

关键词：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；突变体；活性

中图分类号：S476.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）08-0069-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.018

Study on the Loss of Natural Mutant of A Bacillus thuringiensis

WEI Min

（Henan Nursing Vocational College，Anyang 455000，Henan，China）

Abstract： The cry1C gene of a mutant Bacillus thuringiensis natural mutant were cloned and sequenced， and the effects of mutant sites on the protein structure expressed were analyzed by this gene and the causes of loss of activity.

Key words： Bacillus thuringiensis； mutant； activity

蘇云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）简称Bt，其产生的杀虫晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等多种重要的农林业害虫以及线虫、螨类和原生动物具有毒杀作用[1]。菌株G43对夜蛾科害虫甜菜夜蛾有较好的活性，推测其可能含有cry1C类基因[2]，但其基因的具体序列还不清楚。在传代过程中发现其杀虫活性完全丧失，把突变体命名为G39，分析可能是其表达杀虫晶体蛋白的cry基因发生了突变，导致其不能正确地表达杀虫晶体蛋白，造成杀虫活性丧失，为明确该基因发生突变的位点，对该菌株中的cry1C基因及其突变体G39菌株中的基因进行克隆并测序[3，4]，分析其突变位点对该基因表达蛋白构象的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

所用Bt菌株均由中国农业科学院植物保护研究所生物技术组保存；JM109购自Novagen；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

液体LB：Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，120 ℃ 20 min。

酶类：限制性内切酶及连接酶、高保真KOD plus DNA聚合酶、Rnase购自GiBcol、TaKaRa公司。dNTP、Taq酶等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

Bt总DNA提取液：溶液I，0.3%蔗糖，25 mmol/L Tris·Cl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH 8.0），Lysozyme 50 mg/mL；溶液II，0.1 mol/L NaCl，0.1% SDS，0.1 mol/L Tris·Cl（pH 8.0）；溶液III，5 mol/L NaAc，用冰乙酸调至pH 4.8。

1.2 方法

Bt总DNA提取、PCR扩增、基因克隆、质粒提取均为常规方法。

2 结果与分析

2.1 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的克隆

以菌株G43和G39的总DNA为模版，用cry1C的鉴定引物[1]5′-GTTTAGTGTTGGACGCAATTT-3′和5′-CCAGCGCCACCATTTAA-3′扩增检测出菌株G43和G39中确实含有cry1C类基因（图1）。

用全长引物5′-ATGGAGAATAATATTCAAAAT CAATGC-3′和5′-GGAATTACTCCTTATGGAGGAAT AA-3′和KOD plus DNA聚合酶扩增得到全长3.5 kb cry1C的全长DNA（图2）。

将产物回收、纯化，利用Taq DNA聚合酶延伸加“A”尾。最终PCR产物经回收纯化后插入pMD18-T载体中，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆并提取质粒，对该质粒进行酶切鉴定（图3）。

2.2 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的序列测定及分析

对经过PCR和酶切鉴定的阳性克隆进行测序，分别测得菌株G43和G39的全长DNA序列。菌株G43的序列通过NCBI BLAST比对，与cry1Ca9的相似性最高，为99%，全长3 570 bp，1 189个氨基酸，各种氨基酸的个数及占比见表1。由表1可知，谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）和天冬酰胺（Asn）含量最高，分别为8.07%、7.23%、8.66%和7.15%，该Cry1Ca蛋白分子量为134.48 kD，等电点为pH 4.745，是弱酸性蛋白质。克隆cry1C基因为构建对甜菜夜蛾等害虫有高活性的工程菌株创造了条件。

2.3 菌株G39中cry1C基因的突变分析

测序发现，突变体和原始菌株的蛋白序列主要在N端发生了一些变化，由测序得到的G39和G43的cry1C基因推导的氨基酸序列比对如下。

比较发现，突变体的氨基酸序列共发生了8个位点的突变。第1至第5位由MEENN突变为-GGKY，第751位由I突变为V，第1 063位由D突变为G，第1 073位由E突变为G。图4显示了Cry1Ca蛋白的活性区的3个结构域，包括35-625位氨基酸。突变的位点虽然不在该蛋白的活性区域内，但是由于起始密码子的缺失，直接导致了该基因编码的Cry1Ca蛋白不能表达。

3 小结与讨论

本研究在分子水平上验证了菌株在传代过程中确实会出现自然突变体，也为寻找更好的杀虫活性蛋白提供了思路和资源。然而由于自然突变的不确定性，基因突变往往导致杀虫蛋白活性的降低或丧失。本研究通过研究自然突变体活性丧失的原因，进一步明确杀虫蛋白结构和功能之间的关系[5]，为人工改造杀虫基因，提高杀虫活性提供一定的理论依据。

参考文献：

[1] SCHNEPE E，CRICKMORE N，VAN RIE J，et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J].Microbiol Mol Bio Rev，1998，62（3）：775-806.

[2] 曾晓慧，张宏宇，喻子牛，等.苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾幼虫毒力的生物测定方法[J].中国生物防治，1998，14（4）：172-175.

[3] KUO W S，CHAK K F. Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1996，62（4）：1369-1377.

[4] 于 群，张 杰，王晓明，等.产荧光假单胞菌分离鉴定及其质粒DNA复制区的克隆[J].农业生物技术学报，2002，10（1）：77-80.

[5] 魏 敏.杀蚊苏云金芽孢杆菌晶体蛋白结构与功能研究进展[J].安阳工学院学报，2011，10（6）：19-21.