怀山药内生真菌的分离与鉴定

文春南 王晓龙 李守婷 张朋展 叶颖晓 麻兵继

摘要：以怀山药（Dioscorea opposita Thunb）为试验材料，采用组织块分离法和研磨分离法对怀山药根茎中内生真菌进行分离，并运用形态学及分子生物学方法对其进行鉴定。结果表明，共分离得到23株真菌，经鉴定分别为镰孢菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、地霉菌属（Geotrichum）、弯孢菌属（Curvularia）和链格孢属（Alternaria）等6个属。

关键词：怀山药（Dioscorea opposita Thunb）；内生真菌；分子生物学方法；镰孢菌

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）08-0058-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.015

Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Dioscorea opposita Thunb

WEN Chun-nan，WANG Xiao-long，LI Shou-ting，ZHANG Peng-zhan，YE Ying-xiao，MA Bing-ji

（College of Agronomy，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

Abstract： The rhizome of Dioscorea opposita Thunb was used as the experimental material，and then endophytic fungi were isolated by the methods of tissue and grinding separation. The isolated strains were then identified by morphology and molecular biology approaches. The results showed that 23 strains from D. opposita Thunb were identified，which belonged to 6 genera，namely，Fusarium，Penicillium，Aspergillus，Geotrichum，Curvularia and Alternaria.

Key words： Dioscorea opposita Thunb； endophytic fungi； molecular biology approaches； Fusarium

怀山药（Dioscorea opposita Thunb）为薯蓣科多年生植物薯蓣的根状茎，自古以来即是河南省著名的“四大怀药”之一，具有健脾胃、益肺肾、止痢疾、化痰涎等功效，又被称为“怀参”[1]。药典收载的怀山药的药材生产具有明显的地域性，即河南怀庆府（古怀庆府即今河南省焦作一带，含博爱、武陟、沁阳、温县等地）为主要产地[2]。鉴于怀山药具有药食兼用的功效且口感好，国内外市场对怀山药的需求量巨大。当前对怀山药的文献研究多集中于药材人工栽培及其生物功能等方面，而人工栽培的研究又主要集中在怀山药的外部生长环境研究，即气候因子、光照、温度、土壤、水分等[3，4]，对怀山药植株内环境如内生真菌的研究较少。植物内生真菌是指那些在其生活史中某一段时期生活在活的植物组织内，对宿主植物组织不引起明显病害症状的真菌[5]。虽然中药材内生真菌和药材质量之间存在密切联系，是药材道地性形成的关键因子之一，相关研究文献也较多[6，7]。但怀山药内生真菌与药材品质之间的关联性尚缺乏研究。因此，本研究从怀山药的内生真菌分离鉴定着手，分析怀山药内生真菌的多样性，为今后系统研究内生真菌与怀山药品质及道地性之间的关系提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 供试植株样品为河南省焦作市温县农科所怀山药试验基地采集的健壮怀山药植株，品种为铁棍山药。

1.1.2 分离纯化培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基含马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉18 g、去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离和纯化 将怀山药切成小段，取怀山药一小段根用无菌水反复清洗至样品表面彻底干净，再依次用75%乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸钠浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸取表面多余水分，并以最后一次冲洗过的无菌水200 μL涂布于PDA培养基平板上作为空白对照，以检测样品表面的灭菌效果[8]。放入培养箱中继续培养5～15 d，观察培养皿中材料切口处长出菌丝（菌落），待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及出现新菌时间的不同，分别用无菌牙签挑取各平板菌落边缘的菌丝转接于新的空白PDA培养基上，按上述培养条件继续培养2～3代，以确保纯化获得单一菌株。

1.2.2 内生真菌形态学鉴定 参考文献[9]，根据纯化得到的真菌菌落培养特征、菌丝形态、产孢结构类型以及孢子的形态、颜色、大小进行初步分类鉴定。

1.2.3 内生真菌分子鉴定 内生真菌DNA提取：参照真菌基因组DNA小量提取试剂盒步骤进行操作，得DNA溶液，于-20 ℃冰箱中保存、备用。

rDNA-ITS的PCR扩增反应体系，Premix Taq 25 μL，ITS1（20 μmol/L）2 μL，ITS4（20 μmol/L）2 μL，ddH2O 19 μL，DNA模版2 μL，上游引物ITS1：5′-TC

CGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS4：5′-TC

CTCCGCTTATTGAATGC-3′。PCR反应体系50 μL。

PCR扩增程序（每份扩增产物平行3份）：预变性95 ℃，5 min；变性95 ℃，1 min，复性49 ℃，1 min，延伸72 ℃，2 min，30个循环；延伸72 ℃，10 min；4 ℃ 10 min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，1×TAE电泳缓冲液，以100 V电压电泳约40 min，EB染色5 min，由凝胶成像系统进行观察、拍照。检测后置于-20 ℃冰箱中保存、备用。

内生真菌rDNA基因的系统发育分析：将PCR擴增产物交由华大基因科技有限公司进行测序，测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行NCBI BLAST比对分析，采用分子进化遗传分析软件MEGA ver. 5.0构建系统发育树。其中系统进化矩阵按Kimura 2-Parameter模型估算，采用邻接法（Neighbor-Joining）聚类分析构建系统发育树，重复取样 1 000次进行自展值（Bootstrap value）分析，评估系统进化树拓扑结构的稳定性。定义16S rDNA序列相似性大于98%为同一个物种[10]。

2 结果与分析

2.1 内生真菌分离

通过组织分离法从怀山药根中共分离得到23株真菌，经鉴定为6个属，分别为镰孢菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、地霉菌属（Geotrichum）、弯孢菌属（Curvularia）和链格孢属（Alternaria）。

2.2 形态学鉴定

将分离得到的内生真菌依次进行菌落特征和显微观察。如菌株Doef-1，菌丝茂密丰富，棉絮状，白色至乳黄色；有大量分生孢子，锲形至梭状镰刀形；隔膜明显，多数为3个隔膜，少量有4～6个隔膜；厚垣孢子生于分生孢子梗或菌丝短枝的顶端，球形至卵形。按照魏景超[9]的方法初步认为菌株Doef-1为镰刀菌属（Fusarium）真菌。

2.3 分子学鉴定

2.3.1 PCR扩增产物凝胶电泳结果 对分离得到的内生真菌提取DNA，然后进行rDNA-ITS序列扩增，在550 bp处出现一条单一明亮的条带，条带大小与预期目标一致。

2.3.2 rDNA-ITS序列比对以及系统发育树的构建 进一步测序结果显示23个菌株的rDNA-ITS片段大小为500～550 bp，将所获得的内生菌rDNA-ITS片段与NCBI中已知序列进行Blast比对，结果见表1。

对比分离得到的23株内生真菌与其同源性相似的已知16S DNA序列，挑取相似性在97%以上的菌株，利用MEGA 5.0和Clustal X软件构建系统发育树，结果见图1。

由表1及图1可知，粪壳菌纲为优势类群，占内生真菌总数的40%，分离得到的9个菌株（Doef-1、Doef-2、Doef-5、Doef-8、Doef-10、Doef-14、Doef-18、Doeb-19、Doef-20）分属粪壳菌纲的1个属（Fusarium）；7个菌株（Doef-3、Doef-4、Doef-6、Doef-7、Doef-9、Doef-12、Doef-16）分属散囊菌纲的2个属（Aspergillus、Penicillium）；6个菌株（Doef-11、Doef-13、Doef-17、Doef-21、Doef-22、Doef-23）为座囊菌纲的2个属（Curvularia、Alternaria）；半子囊菌纲则分离得到1个属（Geotrichum）的1个菌株（Doeb-4）。其中内生真菌主要分布在镰孢菌属（Fusarium），为怀山药内生真菌中优势菌群。

3 小结与讨论

本试验分离得到23株真菌，经鉴定为6个属。张志东等[11]从山药根中分离到10株内生细菌并鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus）和欧文氏菌属（Erwinia），没有分离到内生真菌，这可能与所选用的山药品种不同有关。张建新等[12]用涂布平板法从铁棍山药分离到32株内生菌，有4株真菌，28株细菌，其中筛选到了11株内生细菌对白菜软腐菌有拮抗作用，但没有对这些内生菌鉴定到属。与上述文献报道不同，本试验所用怀山药样品采于河南省焦作市温县（怀山药产地之一），不同于市售山药，因而分离到的内生真菌种类较多。

怀山药道地性的形成非常复杂，其道地性的科学机制阐明必然是一个复杂的系统研究。本试验作为怀山药道地性系统研究的一部分，研究结果丰富了怀山药内生真菌的种类和资源，填补了怀山药内生真菌研究的空白。为今后进一步研究内生真菌与怀山药道地性之间的关联作用，如内生菌是否具有促进药材生长发育、增强药材抗逆性及促进怀山药药材有效成分积累等作用的研究提供参考。

参考文献：

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[2] 尚志钧.新修本草[M].合肥：安徽科学技术出版社，1981.

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[8] 周 凤，张弘弛，刘 瑞，等.恒山黄芪内生真菌分离鉴定及抗菌活性的研究[J].食品科技，2012，37（1）：22-25，28.

[9] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[10] DEVEREUX R，HE S H，DOYLE C L，et al. Diversity and origin of desulfovibrio species： Phylogenetic definition of a family[J].J Bacteriol，1990，172（7）：3609-3619.

[11] 张志东，谢玉清，楚 敏，等.山药内生菌的分离及菌种鉴定研究[J].新疆农业科学，2010，47（1）：126-129.

[12] 张建新，刘起丽，赵丹丹，等.铁棍山药内生菌的分离及对白菜软腐菌拮抗菌的筛选[J].河南农业科学，2009（10）：94-96.