氟中毒对小鼠睾丸间质组织细胞中IL-17相关基因的影响

裴雪静，吴盼红，吕晓倩，孙子龙，王俊东

(山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

氟是人和动物生存所必需的一种微量元素，其以化合物的形式广泛分布在自然界中，适量的摄入对人体有益，但过量摄入氟则可引起氟中毒，不仅会引起牙齿、骨骼的损害，还会造成肝脏、肾脏、海马、脑及睾丸等全身软组织的严重损害[1]。有研究表明，摄入过量的氟可降低精子质量[2]，而睾丸是雄性哺乳动物精子发生的场所，同时也是一个免疫豁免器官，当缺乏淋巴细胞浸润或血睾屏障作用不完整时会引起睾丸炎[3]，因此本试验以睾丸组织作为靶器官来研究氟的生殖毒性。

大量的研究表明，细胞因子在雄性发挥正常的生殖功能上有很重要的作用[3、4]。白细胞介素17 (Interleukin-17，IL-17)是一种很重要的炎症因子，它可以与其相应的受体IL-17RA和IL-17RC结合形成异物二聚体，进而刺激靶细胞分泌很多种炎症细胞因子，趋化因子和一些抗菌蛋白[5、6]。有研究表明，氟可诱导小鼠睾丸中重要的炎症介质物IL-17的水平升高[7]，但具体的分子机制仍不清楚。本试验通过构建小鼠氟中毒模型，从睾丸中分离睾丸间质组织细胞，检测IL-17相关基因的表达量，来进一步探讨氟对小鼠睾丸产生的毒理学机制。

1 材料和方法

1.1 材料

I型胶原酶购于Sigma公司；DEPC水、RNAiso Plus、Prime ScriptTM RT Master Mix及SYBR Premix Ex TaqTM II kit 购于Takara公司；生理盐水、甲醇以及PBS缓冲液等是实验室常规试剂。

1.2 试验动物及分组

24只健康雄性ICR小鼠由中国辐射防护研究院提供。适应一周后，小鼠被随机分成3组，对照组饮用去离子水，处理组分别饮用含NaF 50 mg·L-1和100 mg·L-1的去离子水，攻毒时间为50 d。饲养期间保持鼠房空气流通、温湿度适宜。

1.3 小鼠精液品质测定

取出附睾尾及输精管，剔除表面脂肪，马上放入含37 ℃生理盐水的培养皿中，用注射器针头冲出精子并转移至管中，检测以下指标。

1.3.1 精子活力的测定

吸取10 μL精子悬液滴于载玻片上，置于显微镜下，电脑录像7～8 s，之后依据精子的运动特征来观察，总计数100条精子，精子活动性好的计数为A。精子活力/%=A/100×100。

1.3.2 精子活率的测定

吸取10 μL精子悬液滴于玻片一侧，伊红染液与精子悬液按1∶1混合，轻轻推片抹匀，在室温下晾干，显微镜下每张片取不同视野计数500条精子，统计精子的活率。

1.3.3 精子密度的测定

吸取10 μL精子悬液，打入红细胞细胞计数板，在显微镜下观察并统计任意5个方格内的精子，根据红细胞计数法，按公式计算精子密度。

1.3.4 精子畸形率测定

吸取上述管中混匀的精子悬液10 μL滴于干净的载玻片一侧，用另一个载玻片倾斜将精子悬液向另一侧均匀抹开，自然干燥，甲醇固定后再次干燥，在高倍镜下观察500条精子并计算畸形率。精子畸形率=畸形精子数/500×100%。

1.4 睾丸间质组织细胞的分离提取

睾丸取出后，撕去睾丸表面的白膜，放入0.3 g·L-1的I型胶原酶中，34 ℃孵育15 min，加冷的PBS，4 min后，200目纱布过滤，收集上清；上清液4 ℃，300 g，离心10 min，倒掉上清液，加入PBS混匀清洗，再一次4 ℃，300 g，离心10 min，若含有红细胞，用NH4Cl低渗，再加PBS混匀，4 ℃，300 g，离心10 min，得到的沉淀小球即为睾丸间质组织细胞，-80 ℃备用。

1.5 IL-17相关基因的表达

1.5.1 总RNA的提取

采用Trizol法提取睾丸间质组织细胞的总RNA。为了验证RNA的质量，用Nanodrop ND-1000 spectrophotometer测定RNA的浓度和A260/A280，A230/A260。

1.5.2 引物设计

按照美国国立生物信息技术中心(NCBI)和Prism3 Plus软件设计小鼠IL-17 A，IL-17RA和IL-17RC的基因序列，引物在上海英潍捷基有限公司合成。基因引物序列见表1。

1.5.3 qRT-PCR反应体系的建立

按TaKaRa试剂盒说明书进行操作，第1步将提取出的RNA反转录成cDNA，分别吸取2.0 μL 5×Prime Script TM Buffe，2.0 μL Total RNA，6.0 μL RNase RNase Free dH20共10 μL体系，混合均匀后进行反转录，反应参数设为37 ℃，15 min；85 ℃，5 sec；第2步进行qRT-PCR反应，分别加入5 uL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)，0.4 μL PCR Forward Primer，0.4 μL Reverse Primer，0.2 μL ROX Reference DyeⅡ(50×)，1 μL cDNA溶液，共10 μL反应体系，扩增条件设为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。

1.6 数据处理

采用Graph pad Prism 5统计软件对试验数据进行分析，选择one-way analysis of variance(ANOVA)方法，采用Dunnett's 多重比较进行检验。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequences

注：F表示上游引物，R表示下游引物。
Note: F means forward primers, R means reverse primers.

2 结果与分析

2.1 精液品质

2.1.1 精子活力检测结果

由表2可见，与对照组相比，各氟组小鼠的精子活力均呈下降趋势，其中中氟组小鼠的精子活力显著降低(P<0.05)，高氟组中极显著性降低(P<0.01)。

2.1.2 精子活率检测结果

由表2可见，与对照组相比，各试验组小鼠的精子活率都呈下降趋势，其中中氟组小鼠的精子活率差异显著(P<0.05)，高氟组差异极显著性(P<0.01)。

表2 各组小鼠精子活力、活率、密度及畸形率测定结果Table 2 Sperm motility、viability、conut and malformation rate of the mice of the each group

注：* 表示与对照组相比差异显著(P<0.05),**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。
Note: * Means compared with control group, significant difference(P<0.05),**Means compared with control group, highly significant difference(P<0.01).

2.1.3 精子密度检测结果

由表2可见，与对照组相比，不同浓度的氟组的精子密度呈下降趋势，其中高氟组小鼠的精子密度显著性降低(P<0.05)。

2.1.4 精子畸形率检测结果

由表2可见，与对照组相比，氟组小鼠的精子畸形率呈上升趋势，其中中氟组精子畸形率显著差异(P<0.05)，高氟组精子畸形率呈极显著差异(P<0.01)。

2.2 IL-17相关基因表达情况

与对照组相比，在高氟组中，IL-17 A，IL-17RA和IL-17RC的mRNA表达量显著升高(P<0.05)，而在中氟组中，IL-17 A，IL-17RA和IL-17RC的mRNA相对表达量有升高的趋势，但均无显著性差异(图1)。

图1 小鼠睾丸间质组织细胞中IL-17 A,IL-17RA和IL-17RC的基因表达量Fig.1 The genes expression of IL-17 A,IL-17RA and IL-17RC in testicular interstitial cell of mice from different groups注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)Note: *Means compared with control group, significant difference(P<0.05)

3 结论与讨论

研究结果表明，氟摄入过量会对雄性的生殖系统造成严重的损害，其中精液质量是评价雄性生殖功能最常用的指标[8]。精液质量分析的经典指标是决定精子品质的主要参数，包括对精子活力、精子活率、精子密度和精子畸形率的检测。本课题组Sun等[9]通过给小鼠饮用含不同浓度NaF的蒸馏水，结果显示小鼠精子活力，活率及精子密度显著降低；Han等[10]通过饮水方式给小鼠不同浓度的氟化钠60天后，在高氟组中，精子畸形率显著升高；Xue等[11]对小鼠进行25～100 mg·L-1NaF的攻毒，发现小鼠精子密度在50 mg·L-1NaF 组和100 mg·L-1NaF组中显著降低，精子活力和精子活率在50 mg·L-1NaF组和100 mg·L-1NaF组中显著降低且差异极显著。本次试验结果显示在攻氟组中，小鼠的精子活力，活率和密度都出现了显著性降低，精子畸形率则显著升高，这也进一步说明了氟引起了小鼠生殖功能的损伤。

IL-17是由辅助性T细胞分泌的特征性细胞因子，作用非常广泛，不但可以诱导前炎症因子、趋化因子以及细胞因子的表达，而且在抵制胞外细菌感染的宿主防御、诱导慢性炎症疾病和各种自身免疫性疾病中扮演着很重要的角色[12]。累积的文献综述报道，在风湿性关节炎，炎症性肠病，系统性红斑狼疮以及银屑病等自身免疫性疾病中，IL-17的表达量显著升高[13]。IL-17及其受体IL-17RA与IL-17RC在机体的免疫系统和其它各疾病的发病机制中占据着很重要的作用。IL-17RA与IL-17RC表达特别广泛，在内皮细胞、表皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞中都有表达[12]。研究结果表明IL-17在睾丸炎中发挥着很重要的作用，特别是在自身免疫性睾丸炎中[14]。本课题组Wei等[7]通过攻氟180 d后，检测小鼠睾丸炎症细胞因子IL-17和L-17RA的基因表达情况，结果显示在100 mg·L-1NaF组中，IL-17 A和17RA的mRNA表达量显著升高，Huo等[15]通过饮水途径给小鼠摄入不同浓度的氟化钠56 d后，IL-17RA 和IL-I7RC的基因表达量在高氟组中显著升高。在本试验中，我们通过建立氟中毒模型，分离提取睾丸间质组织细胞后，检测了与睾丸炎症相关的细胞因子IL-17、IL-17RA和IL-17RC的mRNA表达情况，结果显示IL-17、IL-17RA和IL-17RC的基因相对表达量在高氟组中显著升高，与上述结果一致，这说明氟暴露引起炎症因子IL-17 A水平的升高，产生了睾丸炎进而影响小鼠睾丸发挥正常的生殖功能。

综上所述，氟引起的睾丸炎可能是由于媒介物炎症因子IL-17基因水平的升高引起的，进而影响了睾丸发挥正常的生殖功能，但IL-17在氟作用下具体的作用机制仍需做更深一步的研究。

参 考 文 献

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(编辑：马荣博)