基于mRNA和miRNA表达谱及基因甲基化谱的直肠腺癌发生相关分子标志物的研究

秦海，华扬，石洋，李鹏

直肠腺癌（rectal adenocarcinoma，READ）是消化系统常见恶性肿瘤，全球每年新发病例约120万，死亡人数约占所有恶性肿瘤的8%［1-2］。目前认为结直肠癌变是一个多基因参与的极为复杂的过程，随着二代测序技术的发展，诸多临床及实验研究对其发病机制进行了探讨，但仍未明确。在早期READ（Ⅰ～Ⅱ期）中，LINE-1低甲基化的患者生存期短、肿瘤复发率高［3］。KRAS突变和CDKN2A启动子甲基化与直肠癌的总生存期（overall survival，OS）相关［4］。miR-573、miR-579和miR-802的异常表达影响患者的OS［5］。术前进行放化疗的READ患者中，XRCC3过表达的患者化疗效果更好［6］。一些潜在靶基因与患者生存期和疗效显著相关。本文基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，综合分析READ相关miRNA、mRNA和DNA甲基化数据，以期进一步阐明READ的发病机制并找出潜在早期生物标志物。

1 材料与方法

1.1 数据来源 从TCGA（https://cancergenome.nih.gov/）数据库中下载获得mRNA、miRNA表达数据及DNA甲基化数据和相应的READ患者的临床资料。共包含155例READ患者的组织标本，无其他恶性肿瘤发病史、未接受辅助治疗，其中TNM分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和未知的患者分别为29、49、48、23、6例。mRNA表达数据、miRNA表达数据及甲基化数据的测序平台分别为UNC_IlluminaHiseq_RNASeqV2、BCGSC_Illu⁃minaHiSeq_miRNASeq和JHU_USC_Human Methylation450。

1.2 鉴定差异表达的 mRNAs（DEmRNAs）和 miRNAs（DEmiRNAs） 利用DESeq2软件包鉴定直肠腺癌中DEmRNAs和 DEmiRNAs［8］。 阈值为FDR ＜ 0.000 1且|log2fold change|＞ 2。

1.3 差异甲基化的CpG位点分析 利用R语言中的COHCAP软件包和t检验鉴定READ相对于正常对照标本之间差异甲基化的CpG位点（differentially methylated sites，DMSs）［9］，阈值为校正P＜ 0.05并且|△β|＞0.2。同时对DMSs的相应基因和CpG岛进行GO注释。

1.4 曼哈顿图分析和热图分析 利用R语言中的“qqman”包，绘制差异甲基化CpG位点在22条染色体中的分布图，即曼哈顿图。利用R语言中的“pheatmap”包，绘制正常对照和READ中差异甲基化的CpG位点的双向聚类图。

1.5 DEmiRNAs靶基因预测 利用miRWalk数据库中的RNA22、miRanda、miRDB、PICTAR2 和 Targetscan 预 测DEmiRNAs的靶基因，将至少4个软件同时预测到的靶基因记作DEmiRNAs的潜在靶基因［10］。

1.6 DEmiRNA-DEmRNA网络的可视化 通过PCC分析和miRWalk数据库鉴定出具有负相关性的DEmiRNADEmRNA关系对，并利用Cytoscape软件（http://cytoscape.org）将其可视化［11］。

1.7 DEmRNAs与DNA甲基化的相关性分析 鉴定发生了差异表达及差异甲基化的基因，并分析基因表达与DNA甲基化之间的相关性。

1.8 KEGG途径富集分析 利用KOBAS2.0在线软件进行KEGG通路富集分析，探索异常甲基化且异常表达的基因富集的信号通路。以P＜0.05作为筛选的阈值。

1.9 qRT-PCR验证 从天津市人民医院结直肠外科获得5例READ患者的肿瘤组织和癌旁组织。本研究由天津市联合医学中心伦理委员会批准，符合“赫尔辛基宣言”，所有参与到该研究的患者均签署了知情同意书。使用TRIzol试剂（Invitrogen，CA，USA）提取肿瘤和癌旁组织的总RNA。使用Super-ScriptⅢ反转录试剂盒（Invitrogen，CA，USA）反转录成cDNA。内参基因GAPDH、目的基因引物序列见表1。使用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，Foster City，CA）在 Biosystems 7500（Applied Biosystems，Foster City，CA）上进行qRT-PCR反应。PCR扩增程序为：预变性95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃30 s，循环40次。反应结束后，利用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。

Tab.1 Theprimersfor qRT-PCR表1 qRT-PCR所用到的引物

1.10 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组均数间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEmRNAs的鉴定 数据中共筛选出1 192个DEmRNAs，其中上调439个，下调753个。上调最显著的3个mRNA分别是KRT23、FOXQ1和DPEP1；下调最显著的3个mRNA分别是DPP6、PLP1和SCN7A，表2列举了表达差异最显著的前10个表达上调的及表达下调的基因。

2.2 DEmiRNAs的鉴定 数据中共筛选出27个DEmiRNAs，其中17个上调，10个下调。上调最明显的3个miRNAs分别为hsa-mir-424、hsa-mir-215和hsa-mir-374a，下调最明显的3个miRNAs分别为hsamir-328、hsa-mir-129-1和hsa-mir-129-2，见表3。

2.3 鉴定异常甲基化的CpG位点 数据中共鉴定出6 403个异常甲基化的CpG位点，包括4 275个高甲基化位点和2 128个低甲基化位点，分别位于446个基因上。异常甲基化的CpG位点在22条染色体中的分布情况见图1，异常甲基化CpG位点在22条染色体上均有分布，且在2～15号染色体上分布较多。通过双向聚类分析前100个高甲基化和前100个低甲基化的位点，见图2。

Tab.2 Thetop 10 different expression mRNAsin the READ表2 READ中表达差异最显著的10个mRNAs

Tab.3 The top 10 different expression miRNAsin the READ表3 READ中表达差异最显著的10个miRNAs

2.4 鉴定DEmiRNA-DEmRNA关系对 数据中共鉴定出27个DEmiRNA的668个靶基因。通过可视化DEmiRNA-DEmRNA网络构建结果显示，DEmiRNA与DEmRNA之间共存在1 987个DEmiRNA-DEmRNA关系对，其中7个DEmRNA与DEmiRNA相互作用较强。如图3所示，LONRF2受hsa-mir-335、hsa-mir-20a和hsa-mir-452负调节；has-mir-182负调节 PDZRN4、GNAO1和 CNGA3；hsa-mir-19b-2负调节GNAO1、RSPO2和CNGA3。

2.5 鉴定DNA甲基化-DEmRNA 分析数据发现555个高甲基化的CpG岛定位于441个基因，6个低甲基化的CpG岛定位于5个基因。将此446个基因与668个DEmRNAs进行重合分析，其中的50个基因既发生了差异甲基化也发生差异表达。这50个基因中，11个表达上调，39个表达下调，且均为高甲基化，见图4。

2.6 功能注释 对上述50个基因进行富集分析的结果表明，这些基因富集于9个信号通路，其中6个通路中均出现GRIA4和GNAO1，5个通路中出现GRIN2D，见表4。

2.7 qRT-PCR验证 为进一步验证生物信息学分析结果，随机筛选9个基因进行qRT-PCR检测，验证结果显示，在READ中，ATP2B4、NR3C1、ROR1、PRKCB 的表达水平下调，TCF7、SLC6A6、PDPN、WNT2和ONECUT2的表达水平上调，与生物信息学分析结果一致，见表5。

3 讨论

本研究发现在READ肿瘤组织标本SORCS1、PDZRN4、LONRF2、CNGA3、HAND2、RSPO2 和GNAO1低表达，且这7个基因的CpG岛高甲基化、对应的miRNAs高表达，值得进一步研究。RSPO2是Wnt/β-catenin信号通路的调节因子。在乳头状甲状腺癌、胰腺癌和肺腺癌中，RSPO2均出现表达降低［12-14］。本研究RSPO2明显下调，应属于抑癌基因，但也有研究报道RSPO2过表达可抑制结直肠癌细胞的增殖［15］。GNAO1基因是Gα蛋白亚家族的成员之一。本研究中，GNAO1呈现高甲基化状态，表达水平下调。在肝癌中，GNAO1下调会促进肝癌细胞的增殖并抑制其衰老［16］。同时在胃癌中GNAO1沉默会促进胃癌细胞的增殖，抑制其凋亡［17］。本研究发现，PDZRN4在READ中高甲基化且表达下调，与其在肝癌中的研究结果一致［18］。本研究中，HAND2表达下调并伴随着甲基化水平升高。HAND2在子宫内膜样癌几乎不表达，在敲除HAND2小鼠模型中能够导致癌细胞持续地增殖［19］，然而也有研究发现，HAND2在早期肺鳞癌和成神经细胞瘤中高表达［20-21］。SORCS1和CNGA3在READ中高甲基化且表达下调。LONRF2是明显下调的DEmRNAs之一，本研究显示LONRF2与READ相关。

Fig.4 The comparisonsbetween the DEmRNA,the DEmiRNA targeted by the DEmRNAand the aberrant methylation genes图4 DEmRNAs，DEmiRNAs和差异甲基化DNA的关系

Tab.4 The enriched pathways from the 50 aberrant methylation genes表4 含有50个异常甲基化基因的信号通路

Tab.5 The expression levels of DEmRNAs in the 5 tumor samples and 5 adjacent normal samples of the READ表5 通过qRT-PCR验证5个READ肿瘤组织和癌旁组织中DEmRNAs的表达水平 （n=5，±s）

Tab.5 The expression levels of DEmRNAs in the 5 tumor samples and 5 adjacent normal samples of the READ表5 通过qRT-PCR验证5个READ肿瘤组织和癌旁组织中DEmRNAs的表达水平 （n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别癌旁组织肿瘤组织t ATP2B4 0.990±0.001 0.474±0.004 6.203＊＊NR3C1 1.004±0.001 0.630±0.001 9.850＊＊ROR1 1.042±0.003 0.421±0.000 5.456＊＊PRKCB 0.996±0.000 0.452±0.000 5.903＊＊TCF7 0.984±0.003 22.733±0.493 2.439＊SLC6A6 1.025±0.004 36.833±2.583 4.360＊PDPN 1.009±0.001 7.496±0.001 6.930＊＊WNT2 1.026±0.004 9.840±0.013 5.743＊＊ONECUT2 1.007±0.001 5.616±0.014 3.211＊

本文基于TCGA数据库，鉴定了READ肿瘤组织标本中DEmiRNAs、DEmRNAs和差异甲基化的DNA。RSPO2、GNAO1、PDZRN4、HAND2、SORCS1、CNGA3和LONRF2可能在READ的发生中发挥着重要的作用，本研究为READ发生机制的阐明和早期诊断提供了理论依据。

（图1～3见插页）

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