蜂蜜中金霉素残留提取新方法的探讨

任 钊 关世恒 刘红伟 郑纯宇 付有利 李 娜 高火亮 王鋆坦

（河南省商业科学研究所有限责任公司，河南 郑州 450002）

金霉素（CTC）是一种对多种病原菌有较强的抑制作用的高效广谱抗生素，广泛应用于动物的各种传染性疾病治疗，食用含有金霉素残留的动物肉类会引起人体健康危害，产生一些障碍性疾病。中国是世界第一养蜂大国，蜂产品资源相当丰富，在蜂产品的研究开发方面，尽管工作做了很多，目前我国主要蜂产品的工业化生产效率普遍低下，高新技术的精 、深加工产品非常少，附加值高的产品几乎没有[1,2]。但是世界其他许多国家对蜂类产品的质量要求却越来越高，欧盟、美国等许多国家已明确禁止将此类抗生素用于生产动物源性食品[3]。

目前蜂产品中金霉素残留的提取，一般的方法有溶剂萃取法、吸附法、沉淀法、离子交换法、膜分离技术、高效毛细管电泳技术、双水相技术和反束胶萃取技术等，这些方法大多提取率低、耗时长、易污染，不易于实际的推广应用[4,5]。本文采用溶剂提取脱水处理对蜂蜜中金霉素进行了探索，并用化学发光法进行检测，该方法操作快捷、简便，结果准确、可靠。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜂蜜产品购于郑州市金水区某超市；实验所用试剂均为分析纯，实验用水为高纯水。金霉素标准品购于省食品药品检验所，金霉素（CTC）储备液：称取金霉素标准品0.01g放入50mL容量瓶中，缓慢加入0.1mol/L盐酸至刻度，得到储备液浓度为2×10-4mg/L。超灵敏管式发光仪（Lumat LB 9507，德国）；实验室用超纯水机（Water Purifier，四川）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

称取10.0g蜂蜜待测样品于250mL锥形瓶中，加入30mL无水乙醇、30g无水硫酸镁，固定在振荡仪上提取30min，以6000rpm离心20min，取上清液15mL，氮吹氮吹使溶剂挥发尽，最后用0.01mol/L稀盐酸2.5mL，上机检测。试样3份，2份为空白样品，1份加入适量的1×10-5mg/L金霉素使用液，以考查试样处理效果。

1.2.2 样品检测

Lumat LB9507超灵敏管式发光仪采用两个进样泵喷射式加液方式。具体实验条件：泵1进样量100μl浓度为0.05mol/L的NaIO4；泵2进样量100μl浓度为0.03mol/LH2O2；金霉素、空白和实验筛选体系中有颜色的物质都通过手动进样，加入量100μl，见示意图（图1）。

图1 LB 9507检测原理图

1.2.3 标准曲线的绘制

以金霉素标准使用液浓度为横坐标，以体系产生的相对发光值△I为纵坐标，绘制标准曲线如图2、图3。

图2 低浓度标准曲线

图3 高浓度标准曲线

1.2.4 样品测定

用移液器量取待测样品100μl，加入发光体系中，记录相对发光值△I，代入标准曲线法得出金霉素含量。

2 结果与讨论

2.1 化学发光体系的筛选

实验中拟采用 “信噪比”（△I/I1）作为筛选体系的依据。实验中金霉素标浓度为1×10-6mg/L，本实验考察的化学发光体系有：鲁米诺－高锰酸钾体系、鲁米诺-过氧化氢体系、亚硫酸钠-过氧化氢体系、高碘酸钠-过氧化氢体系、铁氰化钾-鲁米诺体系、鲁米诺-四价铈体系、铁氰化钾-亚硫酸钠体系、重铬酸钾-亚硫酸钠体系、亚硫酸钠-四价铈体系、高锰酸钾-亚硫酸钠体系、铜氨络离子-过氧化氢-CTMAB体系。实验结果显示：高锰酸钾-亚硫酸钠体系、高碘酸钠-过氧化氢体系、铜氨络离子-H2O2-CTMAB体系都可以作为检测金霉素的检测体系，其中高碘酸钠-过氧化氢体系没有颜色干扰，10s即可完成化学发光，在0.6s时产生最大发光值，随后发光逐渐减弱，该发光动力学曲线如图4。

图4 NalO4-H2O2发光动力学曲线

2.2 介质的选择及浓度的影响

实验条件：金霉素标浓度为1×10-6mg/L，泵1进样NaIO4，浓度为0.05mol/L，加入量100μl；泵2进样，H2O2，浓度为0.03mol/L，加入量100μl；金霉素和空白，手动进样，加入量100μl。NaIO4-H2O2化学发光体系一般在酸性溶液中较稳定、较强，实验选择在处理样品时加入一定浓度的H3PO4、HCl、HNO3、H2SO4等酸性溶液。实验结果表明：稀盐酸浓度在0.001mol/L增加至0.01mol/L时，体系的△I/I逐渐增加达到最大，稀盐酸浓度从0.01mol/L增加至0.022mol/L时，体系的△I/I逐渐减小。因此，稀盐酸浓度为0.01mol/L时，效果最好。

图5 盐酸浓度的影响

2.3 干燥剂的筛选

实验室中常用的干燥剂有很多种，根据本实验考察的干燥剂有：无水氯化钙、无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水硫酸钙、无水碳酸钾、氧化钙等。实验结果表明：无水硫酸镁吸水容量大，速度快，且是中性化合物，对实验的干扰性小，试样称取量为10g时，无水硫酸镁用量从15g增加至30g时，样品回收率显著提高，可达92.2%，无水硫酸镁用量从30g再增加40g时，样品回收率走势平缓，并未增加明显。因此，干燥剂选择无水硫酸镁用量为30g时，效果最好。

图6 干燥剂的影响

图7 硫酸镁用量的影响

2.4 提取溶剂的筛选

实验室中常用的提取溶剂有很多种，根据本实验考察的溶剂剂有：石油醚、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇等。实验结果表明：无水乙醇提取效率高，操作简便，试样称取量与提取溶剂为2∶1增加1∶3时，样品回收率显著提高，可达91.8%，试样称取量与提取溶剂为1∶3增加1∶5时，样品回收率走势平缓，并未增加明显。因此，提取溶剂选择无水乙醇用量为试样3倍时，效果最好。

图8 提取溶剂的影响

图9 无水乙醇用量的影响

2.5 提取时间的筛选

本实验采用无水乙醇作为提取溶剂，提取效率高，价格便宜，操作简便，氮吹浓缩过程容易挥发出，不产生溶剂残留。实验结果表明：使用无水乙醇震荡提取时间从10min增加至30min时，样品回收率显著提高，可达92.6%，无水乙醇震荡提取时间从30min增加至60min时，样品回收率走势平缓，并未增加明显。因此，无水乙醇提取时间为30min时，效果最好。

图10 提取时间的影响

2.6 离心时间、转数的筛选

图11 离心时间的影响

试样中抗生素经过提取试剂震荡提取后，采用离心方法使试样固液，考查了离心时间、离心转速对试样提取后回收率的影响。实验结果表明：离心时间从5min增加至20min时，样品回收率显著提高，可达90.5%，离心时间从20min增加至30min时，样品回收率走势平缓，并未增加明显；离心转数从4000r/min增加至6000r/min，样品回收率显著提高，可达90.6%，离心转数从6000r/min增加至9000r/min时，样品回收率走势并未增加明显，反而有所降低。因此，离心时间选择20min、离心转速6000r/min时，效果最好。

图12 离心转速的影响

2.7 条件指标优化

实验结果产生2个分段的线性范围：金霉素浓度0～8×10-7mg/L、10～100×10-7mg/L范围内与相对发光值△I有良好线性关系 ，方法检出限达到10-8mg/L。精密度实验RSD为为2.12%～2.74%，准确度实验，样品加标后回收率为92.6%～97.6%。

3 结论

本文探索了用溶剂提取对蜂蜜中金霉素提取方法进行研究，筛选了适合金霉素检测的化学发光体系，研究发现：样品以1∶3加入无水乙醇、无水硫酸镁后，振荡提取30min，6000rpm离心20min，吸取上清液15mL，氮吹使溶剂挥发尽，最后加入浓度为0.01mol/L稀盐酸2.5mL，可以有效提高蜂蜜中金霉素残留的提取率。该方法操作快捷、简便，结果准确、可靠。

[1]张文文,周金慧,郭伟华,等.2014年国内外蜂产品质量安全研究进展[J].中国蜂业,2015(6):19-24.

[2]李哲.兽药残留分析中样品前处理技术研究进展[J].科研,2016,12(5):313.

[3]张亚欠.蜂王浆和牛奶中兽药残留分析方法研究[J].河北大学,2016.

[4]朱晓丽.蜂王浆中抗生素残留检测方法研究进展[J].工程技术(引文版),2016,3(40):20.

[5]闫小峰.四环素类抗生素残留检测方法研究进展[J].中国兽药杂志,2010(5):47-50.