红掌组织培养过程中的外植体褐变研究

2018-06-07郑萍康丽云黄才华郁琳洁

吉林农业 2018年10期

郑萍康丽云黄才华郁琳洁

摘要：在培养红掌组织的过程中，外植体容易产生褐变现象，从而对红掌组织的正常培养过程造成严重影响。在本文中选取红掌“红粉佳人”作为选材产品，其外植體选取健康植株幼嫩叶片，探究与分析在培养愈伤组织过程中出现褐变的现象。采用不相同的抗坏血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、柠檬酸、叶酸等吸附剂、抗氧化剂、培养基硬度的防褐变现象进行观察与研究。经研究发现，将0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP、4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L均添加到5g/L硬度的琼脂MS培养基中，可在最大限度上对褐变现象进行有效控制，且提升愈伤诱导率。

关键词：外植体；褐变现象；红掌组织

中图分类号： S682.14 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.10.030

红掌又可称作火鹤花、红鹅掌、红掌植物界、安祖花，是天南星科多年生常绿草本植物[1]。红掌的茎叶从基部萌出，呈绿色，全缘，卵心形或者是长圆状心形，茎节较短。哥伦比亚、哥斯达黎加、厄瓜多尔等热带雨林地区盛产红掌，主要是因其适应潮湿温暖、不喜光的外部环境条件，也可附生在岩石上、树上或者是地上。红掌具有较长花期，可常年开花，且放置于水瓶中生长期可长达30天左右，是一种具有极高观赏价值的高档盆栽[2]。在通常情况下，红掌在繁殖过程中主要是以分株为主，必要时可采用扦插作为辅助繁殖，其繁殖速度相对较慢。为了更好地满足与适应市场需求，其繁殖途径主要是以组织培养为主。但在培养过程中容易出现外植体褐变现象，鉴于此，在本次研究中，探索出防褐变的最佳条件，旨在全面增长繁殖系数以及诱导率。

1资料与方法

1.1一般资料

选取红掌“红粉佳人”作为选材产品，其外植体选取健康植株幼嫩叶片，探究与分析在培养愈伤组织过程中出现褐变的现象。采用不相同的抗坏血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、柠檬酸、叶酸等吸附剂、抗氧化剂、培养基硬度的防褐变现象进行观察与研究。

1.2试验方法

选取红掌“红粉佳人”作为选材产品，其外植体选取健康植株幼嫩叶片。采用自来水将试材进行反复冲洗，放置在无菌室超净工作台上，给予75%酒精进行预处理，处理时间控制在30秒。随即在处理过程中再给予0.1%升汞，处理时间控制在8分钟。使用无菌水再次进行反复冲洗，6次即可，轻微震荡直到完全清除升汞。采用无菌滤纸将剩余水分吸干之后，把其叶片切成小方块4～6mm，在不同硬度培养基中进行接种操作。外植体5个/瓶，10瓶/培养基，重复3次[3]。在选取培养基过程中，使用4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS，将30g/L蔗糖加入到其中。除了将浓度不相同的琼脂添加到不同硬度培养基之外，还需将5g/L琼脂添加到121℃的其他试验处理培养基中，进行灭菌操作25min。设定（25±2）℃为最佳培养温度，其每天的阳光照射时长应在13h，光照强度约为1300lx，转瓶时间为每个月1次。待接种2个月后，观察并同步记录褐变情况、愈伤诱导率以及褐变率。基本培养基以4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS培养基为主，将不相同的抗坏血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、柠檬酸、叶酸等吸附剂、抗氧化剂添加到基本培养基中，并对试验处理进行设计，对照组则为未添加抗氧化剂与吸附剂进行试验处理。通过上述方法可分析出，不同添加物处理对愈伤诱导、外植体褐变现象的影响。同样，在分析不同硬度培养基试验处理对愈伤诱导、外植体褐变现象的影响过程中，基本培养基以4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS培养基为主，将浓度不相同的琼脂添加到基本培养基中，对不同硬度试验处理进行设计。此外，将0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP添加到每个处理培养基中。

1.3统计学方法

在SPSS21.0统计软件中算出本次研究所有数据，（X2）（%）分别表示计数资料，（t）（x±s）分别表示计量资料，（P<0.05）则表示为差异明显，存在统计学意义。

2结果和分析

2.1 不同添加物处理对愈伤诱导、褐变现象的影响

待接种2个月后，将抗坏血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、柠檬酸、叶酸添加到培养基中能够发挥出抗褐变的效果。其中，叶酸褐变率最高，活性炭AC褐变率最少。经分析，主要是由于活性炭的吸附能力较强，能够将带有褐色的有毒物质进行吸附，从而在一定程度上避免因有害物质对外植体产生严重影响，使褐变率降低。虽然活性炭的褐变率较低，但会将培养基中生长调节剂进行吸附，大幅降低了愈伤诱导率，对形成红掌愈伤组织具有阻碍作用。因此，在形成红掌愈伤组织的过程中，活性炭AC不是最佳防褐变剂。而通过添加聚乙烯吡咯烷酮，其褐变率为24%，仅次于活性炭，而愈伤诱导率高达76%，高于抗坏血酸VC、柠檬酸、叶酸。总之，在上述5个添加物中，聚乙烯吡咯烷酮具有良好的处理成效，是最佳防褐变剂（详见表1）。

2.2 不同硬度培养基对外植体褐变现象的影响

琼脂浓度越高，则培养基硬度越大。硬度为4的培养基，琼脂浓度为5 g·L-1，其愈伤诱导率最高，而褐变率可达到最低值。随着培养基硬度的不断增加，其褐变率也随之不断提高。经深入分析，认为可能是由于在外植体伤口附近聚集了过多的褐色有害物质而无法得到扩散，从而导致局部有害物质不断累积，最终使褐变程度不断上升（详见表2）。

3讨论

外植体褐变指的是在培养组织的过程中，在培养基中外植体释放出褐色物质，从而导致培养基也随之变成褐色，其培养材料逐渐死亡[4-6]。褐变的发生机制主要是因外植体中的多酚氧化酶以及酚类化合物被逐渐氧化之后所产生一种带有褐色的醌类化合物，并受到酪氨酸酶的影响，与蛋白质进行结合，从而致使其他酶系统失去活性，引起组织代谢紊乱，最终死亡[7]。在正常组织中，酶没有受到活化作用的影响，或者是定位分隔酚与酶，从而降低了褐变率，这样一来，外植体材料在不同培养环境下均能对多酚氧化酶以及酚类化合物产生不同程度的影响。单宁含量、木本植物或者是含有高色素的植物均能产生褐变现象，这主要是因为单宁、木质素、色素是酚类糖苷化合物的合成前体[8]。此外，还应重视季节因素。有相关学者曾在研究报道中指出，在1月份时，欧洲栗所形成的酚类相对较少，而到了6月份左右，显著增加了酚类含量，从而提高了褐变率[9-11]。还有研究证实，外植体组织的不同受伤程度会对褐变造成直接影响。在外植体的切取过程中，应注意避免因增加其伤口面积而提高褐变现象。有研究者提出，选取叶片容易增加外植体褐变，该研究者在培养油棕组织的过程中选取叶片，由于组织出现高度分化从而引起褐变现象，但选取胚培养方式，其褐变率较低[12-13]。因此，在选取叶片中如何有效避免出现褐变现象已成为目前研究者所需面临的重点课题之一，正确控制褐变的方法对成功培养红掌组织具有重大意义。在本次研究中，主要是探究与分析在培养红掌组织的过程中的外植体褐变现象，通过采用不同添加物试验处理及不同硬度培养基等研究方法，对科学合理的处理方式进行有效筛选，从而为后期组织培养提供科学有力的理论支持。总之，外植体褐变现象普遍存在于植物组织的培养中，应对褐变现象的发生机制进行深入分析与了解，从而找寻出适宜外植体的培养条件。

本研究表明，在形成红掌愈伤组织的过程中，活性炭AC不是最佳防褐变剂。而通过添加聚乙烯吡咯烷酮，其褐变率为24%，仅次于活性炭，而愈伤诱导率高达76%，高于抗坏血酸VC、柠檬酸、叶酸。在上述5个添加物中，聚乙烯吡咯烷酮具有良好的处理成效，是最佳防褐变剂。

综上所述，将0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP、4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L均添加到5g/L硬度的琼脂MS培养基中，可在最大限度上对褐变现象进行有效控制，且提升愈伤诱导率。

参考文献

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