新型超临界流体色谱仪在糖类分离分析中的应用研究

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(1.大连大学环境与化学工程学院，大连 116622；2.江苏汉邦科技有限公司，淮安 223005)

糖是人体热能的最主要来源，其分离分析方法备受关注。传统的GC法分离分析糖类虽然具有灵敏度高、快速等优点，但由于糖类的挥发性小，常需要衍生。目前常用的方法是HPLC法，无需衍生化，可与多种检测器联用。在HPLC法中，为了获得好的分离效果，通常使用糖分析柱(氨基柱)，价格昂贵。谢强胜等[1]采用HPLC法测定橘红丸及蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的含量，用prevail carbohydrate ES色谱柱,乙腈-水(体积比77∶23)为流动相,蒸发光散射检测器(ELSD)检测。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖在0.1～1.7 μg/mL范围内有良好的线性关系,相关系数(r)为0.99以上;检出限达到0.0104 μg/mL。样品中糖的加标回收率为96.6%～101.0%,测定结果的相对标准偏差为0.58%～0.28%(n=5)。实际样品检测结果显示,多批橘红丸和蜂蜜样品中4种糖含量存在明显差异,该方法可用于橘红丸中蜂蜜辅料的质量考察。沈少林等[2]采用HPLC-蒸发光散射法同时测定了蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖。杜学慧等[3]也采用HPLC法测定了蜂蜜中的果糖、葡萄糖和蔗糖。岳红等[4]采用HPLC法测定了发酵乳中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖含量。

超临界流体色谱(Surpercritical Fluid Chromatography,简称SFC)是以超临界流体作为流动相，以固体吸附剂或键合到载体上的高聚物为固定相，利用流动相的溶剂化能力来进行分析、分离的色谱过程[5，6]。SFC结合了GC和HPLC二者的特点，既可分析GC不适应的高沸点、低挥发、不稳定的高分子、生物大分子样品，又比LC有更高的柱效率和更快的分析速度，同时在与多种检测器联用和制备方面也比HPLC更具优势。加之最常用的做流动相的超临界流体是CO2，廉价易得，后处理简单，符合节约、环保的理念。由于缺乏商品化的仪器，SFC的发展受到限制，一直没有HPLC应用广泛。近年来，国外仪器厂商开始进行SFC的仪器研发，目前几个知名厂家已经实现了仪器的商品化，国内SFC的研制刚初具规模，仪器的商品化才刚刚起步。

本研究中使用自行研制的超临界流体色谱系统，成功分离了木糖、葡萄糖、蔗糖，考察了有机改性剂种类、浓度、系统背压、流速、温度对分离度的影响，得到了较好的分离结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

NS8001超临界流体色谱仪，江苏汉邦科技有限公司；Alltech-ELSD3300蒸发光散射检测器，美国奥泰。

葡萄糖,分析纯，蔗糖，分析纯，科密欧化学试剂有限公司；D-(+)-木糖,纯度99%,上海宝曼生物科技有限公司；CO2，纯度99.99%，N2，纯度99.95%，洪泽宁淮特种气体有限公司；甲醇，纯度99.95%，乙腈，纯度99.95%，江苏汉邦科技有限公司；乙醇，纯度99.95%，异丙醇，分析纯，国药试剂有限公司。Hedera C18(4.6*250mm,5μm)、Hedera Si (4.6*250mm,5μm)、Hedera Diol (4.6*250mm,5μm)、Hedera PhenyI (4.6*250mm,5μm)、Hedera CN(4.6*250mm,5μm)色谱柱，江苏汉邦科技有限公司。

1.2 样品配制

葡萄糖、蔗糖、木糖3种混合样品各10mg，溶于3mL水中。

1.3 实验条件

总流速2mL/min，CO2流速1.6mL/min，改性剂流速0.4mL/min，操作压力12 MPa，温度40℃，蒸发温度60℃，N2载气流速1.6mL/min。

2 结果与讨论

2.1 色谱固定相对分离的影响

在1.3的实验条件下，加入20%甲醇作为改性剂，对木糖、葡萄糖、蔗糖在硅胶、苯基、氰基、二醇基和C185种固定相上的保留行为进行了对比，分离结果见图1。所用的色谱柱为Hedera C18(4.6*250mm,5μm)、Hedera Si (4.6*250mm,5μm)、Hedera Diol (4.6*250mm,5μm)、Hedera PhenyI (4.6*250mm,5μm)、Hedera CN(4.6*250mm,5μm)。

图1 不同固定相上木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分离谱图

由图1可见，3种糖在硅胶柱上有较好的分离，出峰顺序为木糖、葡萄糖、蔗糖，本节后续实验均在硅胶柱上进行，出峰顺序不变。

2.2 改性剂种类对分离的影响

在1.3的实验条件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色谱柱上对木糖、葡萄糖、蔗糖进行分离，当分别加入20%甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、乙醇(EtOH)、异丙醇(IPA)、乙腈-甲醇5种不同改性剂时，结果如图2。

图2 不同改性剂条件下木糖、葡萄糖、 蔗糖的SFC分离谱图

由图2 可见，加入甲醇时分离效果较好。

2.3 背压对分离的影响

在1.3的实验条件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色谱柱上对木糖、葡萄糖、蔗糖进行分离，加入20%甲醇为改性剂，背压从8MPa上升至16MPa，得到了图3的实验结果。

图3 不同背压条件下木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分离谱图

由图3可见，背压变化对3种糖的分离影响很小。

2.4 改性剂流速对分离的影响

在1.3的实验条件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色谱柱上对木糖、葡萄糖、蔗糖进行分离，加入20%甲醇为改性剂，流速从1.5mL/min上升至3.5mL/min，得到了图4的实验结果。

图4 不同流速条件下木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分离谱图

由图4可见，改性剂流速增大，保留时间缩短。

2.5 改性剂比例对分离的影响

在1.3的实验条件下，在Hedera Si(4.6*250mm,5μm)色谱柱上对木糖、葡萄糖、蔗糖进行分离，加入甲醇为改性剂，比例从10%上升至40%，得到了图5的实验结果。

图5 不同比例改性剂条件下木糖、葡萄糖、蔗糖的SFC分离谱图

由图5可见，比例增大，保留时间会缩短，但是分离度会减小。

3 结论

采用NS8001超临界流体色谱仪成功分离了木糖、葡萄糖、蔗糖，同时考察了固定相种类、有机改性剂种类、系统背压、改性剂流速、改性剂比例对分离度的影响，结果表明：在考察的5种代表性固定相中，样品在硅胶固定相上被很好的分离。有机改性剂种类及浓度对分离均有影响，在5种常用改性剂中，甲醇为改性剂时分离效果最好，且改性剂浓度越大，洗脱能力越强，分离度越小。流速越大，保留时间越短。该实验拓展了国产新型超临界流体色谱仪的应用范围。

[1] 谢强胜，李启艳，王坤，刘春霖.化学分析计量，2013,22(1)：45-47.

[2] 沈少林，陆文琪，张慧雄.理化检验-化学分册，2015,51(9)：1330-1332.

[3] 杜学慧，高艾英，张昊，张鹏.中国计量,2013.(7):84-86.

[4] 岳红，赵贞，刘丽君，李翠枝，邵建波.乳液科学与技术，2017,40(2)：23-26.

[5] 陈青，刘志敏.分析化学，2004,32(8):1104-1109.

[6] 张怡评，洪专，方华，谢全灵，易瑞灶，吴皓.中医药导报，2012,18(7):89-91.