不同除草剂对3株土壤细菌蛋白酶活性的影响

辛顺佳， 杨虹琦， 熊 伟， 杨俊兴， 杨红武， 严永旺

(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128)

近年来，我国化学除草剂用量和使用面积呈现逐年增加的趋势。据全国农技推广中心统计，2009年全国杂草发生面积0.89亿hm2，化学防除面积达0.91亿hm2，挽回粮食损失 2 141万t[1]。由于化学除草剂具有速度快、防效好、省力、省工等优点，因此被农民广泛使用。研究表明，这些除草剂有70%会进入土壤[2]，并且对土壤微生物的活动产生影响[3-4]，进而影响土壤中有机物质的分解速度。微生物是土壤有机物质的最早来源，虽然土壤中微生物数量占有机物质总量的比例很少，但它们对土壤有机物质的转化起着非常重要的作用。土壤有机物质是指那些进入土壤中尚未被微生物分解的动植物残体，其中含氮化合物主要是由各种氨基酸构成的蛋白质，并且大部分蛋白质须要经过微生物分泌产生的蛋白酶作用才能被分解和利用。因此，土壤中产蛋白酶微生物的种群结构、数量及其分泌蛋白酶活性与土壤有机物质中蛋白质的分解速度密切相关，并且在一定程度上可以反映土壤有机质矿化的速率[5-6]。对湖南省烟稻轮作地区耕层土壤养分调查发现，其土壤有机质有逐年升高的趋势，虽然有关除草剂对土壤微生物群落影响的相关研究报道较多[7-9]，但未见针对湖南省烟稻轮作地区耕层土壤分离的产蛋白酶细菌种属及其分泌蛋白酶活性研究的报道。本试验选取生产上广泛使用且作用机制不同的3种除草剂(二甲戊灵、异丙甲草胺和精喹禾灵)为试验材料，系统研究了土壤中分离的产蛋白酶细菌种属及不同除草剂对细菌蛋白酶活性的影响，为探明湖南省烟稻轮作地区土壤有机质逐年升高与大量使用化学除草剂是否有关提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤 供试高有机质土壤样品采自湖南农业大学耘园(YY)、湖南省宁乡县横市镇(NX)、湖南省邵阳市横板桥乡(SY)。经检测已知耘园土壤有机质平均含量为 25.92 g/kg，宁乡土壤有机质平均含量为33.29 g/kg，邵阳土壤有机质平均含量为40.83 g/kg。

1.1.2 供试除草剂 供试除草剂为33%二甲戊灵乳油、720 g/L 异丙甲草胺乳油和10%精喹禾灵乳油，均由市场采购。

1.1.3 培养基 (1)酪素培养基。KH2PO40.360 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，ZnCl20.014 g，Na2HPO4·7H2O 1.070 g，NaCl 0.160 g，CaCl20.002 g，FeSO40.002 g，干酪素4.000 g，琼脂20.000 g，蒸馏水1 L，pH值为7.0～7.2。(2)牛肉膏蛋白胨培养基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水 1 L，pH值为7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 土壤产蛋白酶细菌的分离纯化 称取5 g清除残根杂物的土壤样品，倒入含有45 mL无菌水的150 mL锥形瓶中，振荡20 min，使土样充分打散，即成为10-1的土壤悬液。用移液枪吸10-1的土壤悬液1 mL，放入9 mL无菌水中即为10-2稀释液，如此重复，依次制成10-3、10-4、10-5的稀释液，分别涂布于酪素培养基上。37 ℃培养2 d后，挑取产生蛋白水解圈的菌落，进一步划线直到得到单菌落，对菌株进行编号，斜面保存，置于4 ℃冰箱中。

1.2.2 产蛋白酶细菌的初筛 将分离纯化得到的菌种接种到酪素培养基中，37 ℃恒温培养2 d，挑选生长良好、蛋白水解圈明显较大且透明度高的单菌落，测量其水解圈直径(D)与菌落直径(d)。

1.2.3 产蛋白酶细菌的复筛 在250 mL锥形瓶中加入液体牛肉膏蛋白胨培养基100 mL，121 ℃灭菌30 min，将初筛得到的菌株分别接种于培养基中，37 ℃摇床培养24 h，离心培养液，取上清液1 mL测蛋白酶活性。从每份土壤中选择形态各不相同且酶活性最高的1株细菌作为不同剂量除草剂对细菌及其分泌蛋白酶活性影响的试验菌株。

1.2.4 产蛋白酶细菌种属鉴定

1.2.4.1 形态观察和生理生化鉴定 在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养菌株，37 ℃培养24 h，观察菌落形态。根据《常见细菌系统鉴定手册》[10]和《微生物学实验指导》[11]对菌株进行革兰氏染色、接触酶、甲基红、硝酸盐还原、淀粉水解、葡萄糖发酵、V-P试验等生理生化鉴定。

1.2.4.2 16S rRNA基因测序 委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行菌株的16S rRNA基因测序，所得结果在 GenBank 中进行Blast搜索同源序列，并利用Mega 5.0软件进行同源性分析以确定菌种。

1.2.5 除草剂对细菌产蛋白酶活性的影响 将已鉴定出的细菌以1%的接种量接种到酪素体培养基中，加入不同浓度的除草剂。其中，二甲戊灵使用浓度为0.099、0.198、0.396、0.792、1.584 mg/mL，异丙甲草胺使用浓度为0.36、0.72、1.44、2.88、5.76 mg/mL，精喹禾灵使用浓度为0.033、0.066、0.132、0.264、0.528 mg/mL；以不加除草剂的酪素体培养基为对照。37 ℃摇床培养48 h，离心培养液，取上清液测蛋白酶活性和游离氨基酸含量。

1.2.6 蛋白酶活性测定 取5 mL 0.6%酪蛋白溶液于试管中，40 ℃预热2 min后加19 mL pH值为8的硼酸缓冲液和 1 mL 酶液，40 ℃水浴反应10 min，再加5 mL 0.4 mol/L三氯乙酸终止反应，40 ℃保温20 min，沉淀残余底物并过滤，滤液在275 nm下用紫外分光光度计测定吸光度。以先加三氯乙酸使酶失活的试管为空白对照，以1 min内由酪蛋白释放出的三氯乙酸可溶物在275 nm处的吸光度与1 μg的酪氨酸相当时，其所需的酶量为1个单位，单位为U/mL。

1.2.7 游离氨基酸含量测定 采用茚三酮显色法测定[12]。

2 结果与分析

2.1 土壤产蛋白酶细菌筛选

从3份供试土壤中共计筛选出37株产蛋白酶细菌，菌种编号、透明圈直径与菌落直径之比及细菌蛋白酶活性的测定结果见表1。根据透明圈直径与菌落直径之比及蛋白酶活性，选择蛋白酶活性较高的YY-4、NX-3和SY-2菌株进行生理生化特性及16S rRNA基因分析和鉴定。但通过观察发现，YY-4和SY-2菌落形态相似，因此SY地点选用 SY-9 菌株进行试验。YY-4菌株蛋白酶活性最高，其次为NX-3菌株，SY-9菌株蛋白酶活性最小。

表1 产蛋白酶细菌筛选结果

2.2 产蛋白酶细菌鉴定

2.2.1 产蛋白酶细菌形态与生理生化特性 YY-4菌落为乳白色、圆形突起、表面光滑、白蜡状；NX-3菌落颜色为乳白色偏黄、圆形、表面光滑、湿润；SY-9菌落为乳黄色、不规则形蔓延、半透明、表面光滑、湿润。3株产蛋白酶细菌主要生理生化指标分析结果见表2。3种细菌的革兰氏染色、接触酶、硝酸盐还原、葡萄糖产酸和葡萄糖产气特性均相同，但甲基红显色、淀粉水解和V-P特性有所不同。

注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。

2.2.2 产蛋白酶细菌16S rRNA基因鉴定 3种细菌16S rRNA基因的PCR产物电泳图谱见图1。经测序得到的16S rRNA基因序列长度分别为YY-4长1 496 bp；NX-3长 1 496 bp；SY-9长1 492 bp。将得到的基因序列与Blast、GeneBank数据库中的序列进行比对，并利用Mega 5.0软件进行同源性分析，根据细菌鉴定中核糖体基因16S区域同源性大于99%可视为同一个种属的准则，确定菌株YY-4为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)；NX-3菌株为芽孢杆菌属(Bacillussp.)；SY-9菌株为短小芽孢杆菌(B.pumilus)。

2.3 除草剂对3种细菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量的影响

2.3.1 二甲戊灵对3种细菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量的影响 二甲戊灵通常作为芽前、芽后旱田土壤除草剂[13]，广泛应用于玉米、大豆、马铃薯、烟草、蔬菜等田地除草。二甲戊灵对3种细菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量的影响见图2、图3。结果显示，二甲戊灵浓度低于 0.198 mg/mL 时，对蜡样芽孢杆菌和NX-3菌株蛋白酶活性无抑制作用，但对短小芽孢杆菌蛋白酶活性有抑制作用；当二甲戊灵浓度超过0.198 mg/mL后，3种菌株产蛋白酶活性均迅速下降。蜡样芽孢杆菌培养液中氨基酸含量的变化与蛋白酶活性变化基本一致，但在低浓度的二甲戊灵中，NX-3菌株和短小芽孢杆菌培养液的氨基酸含量持续下降。由此可见，二甲戊灵对短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和NX-3菌株产蛋白酶活性均有抑制作用，并且低浓度的二甲戊灵(超过 0.198 mg/mL时)对短小芽孢杆菌、 NX-3 菌株的抑制作用较强，对蜡样芽孢杆菌的抑制作用相对较弱。

2.3.2 异丙甲草胺对3种细菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量的影响 异丙甲草胺是一种选择性苗前使用的土壤除草剂[14]，可用于棉花、花生、马铃薯、烟草等田地除草。异丙甲草胺对3种细菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量的影响见图4、图5。异丙甲草胺浓度低于0.36 mg/mL时，对蜡样芽孢杆菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量均无抑制作用，但对NX-3菌株和短小芽孢杆菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量有一定的抑制作用；异丙甲草胺浓度超过0.36 mg/mL后，蜡样芽孢杆菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量均急速下降。说明当异丙甲草胺浓度超过0.36 mg/mL后对3种细菌蛋白酶活性都有较强的抑制作用。

2.3.3 精喹禾灵对3种细菌蛋白酶活性及培养液中氨基酸含量的影响 精喹禾灵是一种新型的芳基苯氧基丙酸类除草剂[15]，可用于大豆、烟草、棉花、花生、油菜等田地除草。精喹禾灵对3种细菌蛋白酶活性及细菌培养液中氨基酸含量的影响见图6、图7。结果表明，低浓度的精喹禾灵对蜡样芽孢杆菌、NX-3菌株、短小芽孢杆菌蛋白酶活性和培养液中氨基酸含量都有很强的抑制作用。

3 结论与讨论

前人研究结果表明，2，4-D[3]、阿特拉津[4]、草甘膦[8]、苄嘧磺隆[9]等除草剂会影响土壤细菌的数量；甲磺隆的施入不仅会影响微生物生物量和微生物群落结构，而且对土壤微生态系统会产生一定的破坏作用[16]。滕春红等的研究表明，氟磺胺草醚对土壤蛋白酶活性表现出抑制作用，低浓度(5、10 μg/kg)的氯嘧磺隆对蛋白酶活性有轻微的激活作用，而高浓度(20、100 μg/kg)的氯嘧磺隆对蛋白酶活性有抑制作用[17-18]。本试验研究了二甲戊灵、异丙甲草胺、精喹禾灵这3种除草剂，发现它们在低浓度时均对蜡样芽孢杆菌、NX-3菌株、短小芽孢杆菌的蛋白酶活性有明显的抑制作用。但由于这3种除草剂的作用机制各不相同，所以相同条件下对不同细菌蛋白酶活性的影响略有不同。

土壤蛋白酶是土壤氮素矿化过程中的重要水解酶，其酶活性在一定程度上可以反映土壤中分泌蛋白酶细菌的数量，也可以反映土壤氮素矿化的速率。Kamimura等研究表明，蛋白酶与全氮矿化速率呈显著正相关关系[6]。因此，揭示不同除草剂对细菌蛋白酶活性的影响将为除草剂对土壤矿化速率影响的研究奠定坚实的理论和试验基础。本试验仅以高有机质土壤中分离出的3种产蛋白酶活性较高的细菌为供试对象，研究除草剂二甲戊灵、异丙甲草胺、精喹禾灵对细菌蛋白酶活性的影响，而这3种除草剂是否对细菌分泌的其他水解酶或氧化酶活性有抑制作用还有待今后做进一步的研究。

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