高效液相色谱波长切换法同时测定百效丸中6种主成分的含量

2018-06-07张铭马丽颖

安徽医药 2018年6期

张铭，马丽颖

(辽宁中医药大学附属医院制剂中心，辽宁沈阳 110032)

百效丸由玄参、巴豆霜、厚朴、川贝母、柴胡等12味中药材加工而成，为棕红色的大蜜丸，气香、味凉、微辛，具有消积理滞、镇惊化痰的功效，临床用于寒热凝结、停食宿水、腹疼腹胀、痰喘气促、慢惊风症等。百效丸收载于《中药成方制剂第二册》，现行质量标准未对百效丸中任何成分进行定量测定[1]，也未检索到对该制剂进行多组分测定的文献报道，为全面控制本品质量，本研究采用高效液相色谱(HPLC)波长切换法同时测定处方中玄参[2]主成分哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷，巴豆霜主成分巴豆苷，厚朴[2]主成分和厚朴酚[3]、厚朴酚的含量，为提高百效丸质量标准提供了数据支持。

1 仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(型号：Agilent 1100系列，生产厂家：美国安捷伦公司)；电子天平(型号：AXS205DU型，生产厂家：梅特勒-托利多仪器有限公司)；数控超声波清洗器(型号：KQ3200DB型，生产厂家：昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药与试剂百效丸来源于天津达仁堂京万红药业有限公司，批号分别为162156、162175、162182；乙腈、甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯；哈巴苷对照品(111729-201506)、哈巴俄苷对照品(111730-201508)、巴豆苷对照品(111856-201001)、和厚朴酚对照品(110730-201614)、厚朴酚对照品(110729-201513)均购于中国食品药品检定研究院；安格洛苷C对照品(115909-22-3)购于上海宝曼生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件采用Venusil MP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：乙腈-甲醇(1∶4)，流动相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脱(0～20 min，48.0%A；20～26 min，48.0%A→54.0%A；26～35 min，54.0%A→60.0%A；35～49 min，60.0%A→75.0%A；49～55 min，75.0%A→48.0%A)；0～20 min时在210 nm[4-7]波长下检测哈巴苷，20～26 min在280 nm[4,6,8-9]波长下检测安格洛苷C和哈巴俄苷；26～55 min在294 nm[10-11]波长下检测巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚；柱温：30 ℃；进样量为10 μL；流速：0.9 mL·min-1。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液分别精密称取对照品哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚各适量，用50%甲醇分别制成每毫升中含哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚各为0.796、0.530、0.490、1.382、1.058、1.874 mg的单成分对照品储备溶液。再分别依次量取2.5、1.0、1.0、2.5、2.5、2.5 mL，置同一量瓶中(50 mL)，用50%甲醇稀释制成百效丸检测用混合对照品溶液。

2.2.2百效丸供试品溶液取百效丸适量，剪碎，称取4.0 g，精密称定，将其置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定其重量，KQ3200DB型数控超声波清洗器超声提取30 min，放冷，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得百效丸供试品溶液。

2.2.3阴性样品溶液按百效丸的处方和工艺过程，分别制备不含玄参、巴豆霜、厚朴(姜制)的阴性样品，再按“2.2.2” 项下的方法制成玄参阴性样品溶液、巴豆霜阴性样品溶液、厚朴阴性样品溶液。

2.3专属性试验精密吸取“2.2.1～2.2.3”项下的混合对照品溶液、百效丸供试品溶液、玄参阴性样品溶液、巴豆霜阴性样品溶液和厚朴阴性样品溶液各适量，按上述方法进行检测。结果阴性样品色谱图中，在对照品混合液所显示的哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚对应的位置无干扰，各峰之间的分离度大于1.5，理论塔板数均大于3 500，色谱图详见图1。

注：1为哈巴苷,2为安格洛苷C,3为哈巴俄苷,4为巴豆苷,5为和厚朴酚,6为厚朴酚

2.4线性关系考察分别精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别用50%甲醇稀释至20 mL，振摇均匀，制成20倍浓度差的6种不同浓度的混合对照品溶液，依法测定，以哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚及厚朴酚的质量浓度X为横坐标，测得的哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程，如表1所示。

表1 线性关系考察结果

2.5加样回收率试验分别精密称取对照品哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚及厚朴酚各适量，用50%甲醇分别溶解并稀释制成含哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚及厚朴酚为0.916、0.323、0.281、0.807、0.719、0.596 g·mL-1单一成分对照品溶液，备用。

取百效丸(批号162156)6份，剪碎，每份约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，依次精密加入上述备用对照品溶液1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、4.0 mL，再按“2.2.2”的方法制备加样回收样品溶液，依法测定，计算哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚及厚朴酚的回收率及相应的RSD，结果它们的回收率与相应的RSD见表2～4。

表2 哈巴苷加样回收率实验结果

表3 安格洛苷C加样回收率实验结果

表4 哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚加样回收率实验结果

2.6重复性试验取百效丸样品(批号162156)，按“2.2.2”项下制备方法制备百效丸供试品溶液6份，按“2.1”项下的色谱条件及检测方法进行测定，分别计算哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量，结果所测6种组分含量的RSD依次为0.42%、1.51%、0.76%、1.13%、1.24%和0.90%。

2.7精密度试验取“ 2.2.1”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，依法测定各成分峰面积，结果哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚峰面积的RSD (n=6)分别为1.16%、0.25%、1.29%、0.93%、1.10%和0.82%。

2.8供试品溶液稳定性试验取同一份百效丸供试品溶液，于室温下0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h进样测定哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积值，结果室温下10 h内稳定，所测6种组分峰面积的RSD分别为1.18%、0.74%、1.30%、0.96%、1.05%和0.54%。

2.9样品测定取三批百效丸样品，按“2.2.2”项下制备方法制备百效丸供试品溶液，依法进样测定结果见表5。

表5 含量测定结果/mg·g-1

3 讨论

3.1流动相的选择在试验过程中，作者首先考察了甲醇-水[12-13]、乙腈-水[4]、乙腈-甲醇(1∶4)与水[14-16]流动相体系，以色谱峰基线平稳情况和所测各成分的峰形、分离效果为指标，优选最佳的流动相体系。结果显示乙腈-甲醇(1∶4)与水流动相体系优于甲醇-水流动相体系和乙腈-水流动相体系，但个别色谱峰峰形和分离效果还欠佳。在此基础上，作者又考察了乙腈-甲醇(1∶4)与1.0%冰醋酸溶液[5]、乙腈-甲醇(1∶4)与2.0%冰醋酸溶液[11]、乙腈-甲醇(1∶4)与0.2%磷酸溶液[17]、乙腈-甲醇(1∶4)与0.5%磷酸溶液[10]流动相体系，实验结果显示以乙腈-甲醇(1∶4)与0.2%磷酸溶液作为流动相按照文中的梯度洗脱比例进行洗脱时，所测各成分哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚峰形较好，各色谱峰之间以及各色谱峰与杂质峰之间均能达到有效分离。

3.2提取方法的选择在提取方式的选择上，作者分别尝试了加热回流提取和超声提取，结果加热回流提取和超声提取效果差异不大，考虑到检验过程操作的便捷性，优选超声提取作为百效丸供试品溶液的提取方式；在此基础上，作者又以所测成分哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚朴酚、厚朴酚提取率为指标，对比考察了超声提取时间(15、30、45 min)和提取溶剂(水、50%甲醇、70%甲醇)。实验结果表明，以50%甲醇为提取溶剂时，所测各成分综合提取率最佳；超声提取15 min时，部分所测成分含量偏低，超声提取30 min和超声提取45 min所测各成分含量差异无统计学意义。故本文采用50%甲醇超声提取30 min作为百效丸供试品溶液的制备方法。