白芷总香豆素联合白芷挥发油对大鼠偏头痛的预防作用及其机制
2018-06-01倪红霞王春梅
倪红霞，王春梅
(1.北华大学基础医学院形态学实验部，吉林 吉林 132013；2.北华大学药学院药理教研室，吉林 吉林 132013)
偏头痛是一种原发性颅内血管运动和神经功能调节失常所引起的复发性疾病，具有病程长、间歇性反复发作和缠绵难愈的特点[1]。全世界有2.4亿偏头痛患者每年要经受14亿次偏头痛的折磨，世界卫生组织(WHO)认为：重度偏头痛位居最常见的使人丧失工作能力内科疾病的前20位。偏头痛的病因病机复杂，众说不一，目前最具说服力的是三叉神经血管学说[2]。该学说认为：偏头痛是由于刺激激活了三叉神经末梢，后者释放血管活性肽，使脑膜血管收缩舒张发生障碍，引起硬脑膜神经源性炎症。其中起重要作用的是降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、P物质(substance P,SP)及内皮素(endothelin,ET)等[3-4]。由于偏头痛的发病机制复杂，目前尚无理想的治疗药物。临床常用的阿司匹林和麦角胺等虽价格较低易于接受，但不良反应多，服后多有依赖性或成瘾性等，90年代后用于临床的曲坦类，如选择性激动5-HTIB/D受体，能有效控制偏头痛发作，但价格昂贵，且有心血管不良反应[5-7]。
祖国传统医学认为：偏头痛属于中医学的“头风”、“边头风”和“偏头风”范畴。白芷(AngelicaedahuricaeRadix)自古就是一味治疗头痛的良药，我国第一部药学专著《神农本草经》即有白芷治疗“头风”的记载。现代药学研究[8]表明：香豆素(coumarin)和挥发油(volatile oil)是白芷的主要活性成分，单独应用均具有一定的镇痛抗炎作用。薛艳萍等[9]发现：白芷这2种主要成分有“相须”作用，合用时抗炎镇痛作用增强。本课题组前期研究[10]结果也表明2种成分构成的组合物的镇痛抗炎作用增强。但白芷治疗偏头痛的主要药效学物质基础尚不明确，2种成分联合应用是否具有协同抗偏头痛作用尚未见报道。因此本研究将不同浓度白芷总香豆素与白芷挥发油进行组合，观察其对硝酸甘油诱导大鼠偏头痛的预防作用，为白芷的进一步开发和利用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物、药品、主要试剂和仪器 70只清洁级健康雄性Wistar大鼠，体质量(170±10)g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK(吉)2012-0003。实验前适应性喂养1周，选择状态良好的大鼠(56只)纳入实验，采取分笼饲养，室温控制在18℃～22℃，湿度40%～60%，自然光照。保证大鼠自由采食，饮水，每3 d更换1次无菌垫料。实验用白芷饮片(批号：20120906)购于吉林省吉林市江城大药房。白芷总香豆素制备[11]：白芷粉碎，40目过筛，加入8倍乙醇，静置15 min使其湿润均匀，微波辐射150 s，加热回流2次，每次30 min，提取并合并过滤液，旋转蒸发浓缩烘干得白芷香豆素，得率为0.767%。白芷总挥发油制备[12]：称取白芷，研磨粉碎，40目过筛，投入萃取釜中，加热萃取釜和解析釜，20～50 L·h-1送入CO2气体，调节各釜压力后开始循环萃取，萃取压力为17.8 MPa，萃取温度为 54.3 ℃ ，萃取时间为 175.1 min，得到粗制挥发油，得率为3.39%。粗制挥发油加入适量乙醚混合静置，取出乙醚层，水层重复加入乙醚并取出乙醚层，反复3次，合并乙醚层液体，室温吹干，得白芷挥发油。白芷香豆素与挥发油组合物以总香豆素和挥发油按3∶1比例混合而成，实验时采用生理盐水配制成所需浓度的混悬液。硝酸甘油为北京益民药业有限公司生产，NO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，CGRP和ET ELISA检测试剂盒购于北京碧云天生物技术研究所。全自动酶标仪(infiniteM200)购于瑞士TECAN集团公司， SC5 + 1 型二氧化碳超临界萃取装置购于德阳四创科技有限公司。
1.2 偏头痛大鼠模型的制备和给药 56只Wistar雄性大鼠随机分为7组，每组8只，分别为正常对照组(生理盐水0.1 mL·10 g-1)，偏头痛模型组(生理盐水0.1 mL·10 g-1)，白芷香豆素组(100 mg·kg-1)，白芷挥发油组(100 mg·kg-1)，低(25 mg·kg-1)、中(50 mg·kg-1)和高剂量(100 mg·kg-1)白芷香豆素和白芷挥发油组合物组(组合物组)。各组大鼠连续灌胃给药7 d，末次给药后，偏头痛模型组和各给药组大鼠皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模1次，皮下注射主要定位于额区、颞区或右肩部皮下，正常对照组大鼠注射生理盐水。造模3 min后，动物陆续出现烦躁不安、双耳发红和前肢频繁搔头等现象。此现象持续约3 h，继而出现蜷卧、活动减少和安静等状态，表明偏头痛动物模型复制成功。
1.3 大鼠行为表现观察 大鼠行为表现评定标准：“甩头次数”为大鼠每甩头1次为计数1次；“前肢挠头”为大鼠前肢单肢或两肢从头顶部频繁往前挠，每挠1次即“梳头1次”为计数1次；“后腿拍脸”为大鼠单侧后肢不停拍打头面部，以连续拍打每暂停1次为计数1次。采取时间分段计数法(每30 min为1个时间段)立即记录各组大鼠行为学变化(以甩头、前肢挠头和后腿拍脸次数分别作为观察指标)，连续记录3 h。
1.4 各组大鼠血清中NO水平检测 于造模后4 h，各组大鼠以乌拉坦(100 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血1 mL分离血清，采用硝酸还原酶法测定各组大鼠血清中NO水平。
1.5 各组大鼠血浆中 CGRP和ET 水平检测 1.4中大鼠腹主动脉取血3 mL，注入含10% 乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 30 μL和抑肽酶10 μL (含100 U· mL-1以上)的试管中，4℃、3 000 r ·min-1离心10 min分离血浆，采用ELISA法测定血浆中CGRP和ET水平。
1.6 各组大鼠脑组织中 NO水平检测 上述大鼠取血后，于冰台上断头取出脑组织，迅速分离脑干、丘脑和皮质组织，采用冰冷的生理盐水冲洗，除去血迹，滤纸拭干，称质量，制备浓度为10%的脑组织匀浆，检测大鼠脑组织中NO水平。
2 结 果
2.1 各组大鼠行为表现 大鼠皮下注射硝酸甘油后均出现双耳发红、前肢频繁挠头、后腿频繁拍脸和烦躁不安等现象，此现象持续约3 h，继而出现蜷卧、活动减少及安静等状态，表明偏头痛大鼠模型造模成功。与偏头痛模型组比较，造模后0～180 min的各个时间段，白芷香豆素组、白芷挥发油组和低、中及高剂量组合物组偏头痛大鼠的甩头、前肢挠头和后腿拍脸次数均有不同程度减少(P<0.05或P<0.01)。见表1～3。
表1 各组大鼠甩头次数
GroupDose(mg·kg-1) Frequency of head shaking (times·30 min-1)0-30 min30-60 min 60-90 min 90-120 min120-150 min 150-180 minNormal control 05.3±1.04.4±1.23.4±1.02.6±1.21.7±1.10.8±0.5Migraine model 019.8±3.9**14.9±2.5**9.1±1.8*7.3±1.5*5.5±1.2*1.6±1.2Total coumarin10017.3±2.912.3±1.9△8.5±1.46.9±1.14.6±0.91.3±0.7Essential oil10014.1±2.19.1±1.26.7±1.55.9±1.4△4.1±1.11.3±1.0Composition2517.5±4.012.0±2.0△8.3±1.86.6±1.24.8±1.51.4±0.95014.8±2.8△9.6±1.4△6.4±1.4△5.5±1.0△3.7±1.4△1.5±0.810011.6±1.7△△6.7±1.5△△5.4±1.7△4.8±1.2△3.0±1.0△1.3±0.9
*P<0.05，**P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with migraine model group.
表2 各组大鼠前肢挠头次数
GroupDose(mg·kg-1)Scratching times (times·30 min-1)0-30 min30-60 min 60-90 min 90-120 min120-150 min 150-180 minNormal control 020.5±3.417.5±5.08.8±3.06.4±2.14.9±1.22.8±0.6Migraine model 065.2±7.7**57.5±5.2**36.1±4.0**23.4±2.0**10.7±2.1**7.2±1.5**Total couma-rin10055.2±6.9△47.6±5.4△33.8±2.313.6±2.110.1±2.05.4±1.3Essential oil10046.5±3.5△△36.9±3.2△△26.1±1.9△△9.9±1.2△8.0±1.1△△3.9±0.9△Composition 2554.5±7.2△46.8±5.3△32.0±2.5△11.8±1.99.5±2.25.2±1.45050.2±3.1△41.2±2.8△25.5±1.6△10.0±1.4△8.1±1.5△4.4±1.0△10045.4±3.2△△34.2±3.0△△22.7±1.8△△9.6±1.1△△7.4±1.0△△3.2±0.8△△
*P<0.05，**P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with migraine model group.
表3 各组大鼠后腿拍脸次数
GroupDose (mg·kg-1)Face shoting times (times·30 min-1)0-30 min30-60 min 60-90 min 90-120 min120-150 min 150-180 minNormal control 01.2±0.91.1±1.22.5±1.02.7±1.31.0±1.00.0±0.0Migraine model 059.2±4.66**38.2±3.9**20.1±3.1**16.8±2.0**11.5±1.3**5.0±1.6**Total coumarin10050.4±6.1△32.0±3.6△18.1±3.5△14.7±1.710.7±1.63.9±1.3Essential oil10039.4±1.5△22.3.±1.9△15.4±1.7△11.9±1.7△7.6±1.3△2.5±1.6△Composition 2548.9±5.6△31.3±4.2△17.5±4.7△14.5±2.8△10.4±1.43.5±1.15042.5±1.8△25.3±1.9△16.0±2.7△12.5±1.6△8.1±1.5△2.8±0.9△10031.7±1.4△△16.8±2.2△△13.1±2.0△△9.6±1.7△△6.9±1.2△△2.4±1.1△
*P<0.05，**P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with migraine model group.
2.2 各组大鼠血清和脑组织中NO水平 硝酸甘油为NO供体。偏头痛模型组大鼠皮下注射硝酸甘油4 h后，血清和脑组织中NO水平均明显高于正常对照组(P<0.05或P<0.01)。与偏头痛模型组比较，白芷香豆素组、白芷挥发油组和各剂量组合物组大鼠血清及脑组织中NO水平均降低(P<0.05或P<0.01)；其中白芷挥发油组和高剂量组合物组大鼠血清中NO水平明显降低(P<0.01)。见表4。
表4 各组大鼠血清和脑组织中NO水平
GroupDose(mg·kg-1)Levels of NO Serum [cB/(μmol·L-1)]Brain tissue [wB/(μg·g-1)]Normal control 02.5±1.1127±25 Migraine model 022.8±5.4**158±24*Total coumarin10016.1±4.7△147±26Essential oil10010.7±3.6△△131±30△Composition2516.7±5.2△149±255014.1±3.8△133±31△100 4.4±1.0△△129±32△
*P<0.05，**P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with migraine model group.
2.3 各组大鼠血浆中CGRP和ET水平 与正常对照组比较，偏头痛模型组大鼠血浆中CGRP和ET水平明显升高(P<0.05 或P<0.01)；与偏头痛模型组比较，白芷挥发油组和中、高剂量组合物组大鼠血浆中CGRP和ET水平降低(P<0.05)。见表5。
表5 各组大鼠血浆中CGRP和ET水平
GroupDose (mg·kg-1)CGRP ET Normal control 0112.54±7.1120.1±10.1Migraine model 0126.4±8.6**135.1±8.1*Coumarin100120.4±4.9131.7±12.3△Essential oil100115.7±10.1△129.2±8.1△Composition25118.6±5.4130.9±15.150116.9±3.8△130.2±9.2100113.4±11.4△126.2±7.6△
*P<0.05，**P<0.01 compared with normal control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with migraine model group.
3 讨 论
白芷为伞形科( Umbeliferae) 当归属 (Angelica )植物白芷AngelicaDahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f. 或杭白芷AngelicaDahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)ShanetYuan的干燥根。中医临床应用白芷治疗偏头痛已有2 000多年历史，著名中药复方制剂都梁丸、头风痛丸和正天丸中均含有白芷，疗效显著。《本经》谓其“主中风入脑头痛”，白芷芳香上达，辛散温通，祛风止痛，善治阳明头痛。白芷的主要成分为香豆素和挥发油两大类，研究[9]显示2种成分合用具有协同抗炎镇痛作用。
为探讨白芷总香豆素和挥发油对偏头痛的协同预防作用，本课题组采用硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠模型[13]，观察其抗偏头痛效果。大鼠在单次头部皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1后，出现一系列与人类偏头痛相似的头部不适症状，其中“甩头”、“前肢挠头”和“后腿拍脸”3个症状尤为明显，症状出现频繁且可量化，因此以30 min 作为一个时间段观察大鼠各行为学指标变化[14]。为进一步探讨药物的作用机制，本研究还检测了大鼠血清及脑组织中NO、CGRP和ET的水平。
硝酸甘油是NO 的供体，易透过血脑屏障进入大脑，进入体内首先被转化为NO[15]。NO一方面与受体结合，促进环磷鸟苷(cGMP)合成，降低细胞膜的K+通道活性，抑制细胞Ca2+内流，松弛血管平滑肌，扩张脑血管，引发血管扩张性头痛[16]；另一方面，NO可激活脑血管周围三叉神经末梢，介导多种血管活性物质释放(如CGRP等)，产生神经源性炎症[17]。一系列临床或动物实验研究[18-19]证明：偏头痛患者或动物血液和脑脊液中的NO水平明显升高，通过有效的药物治疗，可以降低NO水平并缓解偏头痛症状。本研究中，注射硝酸甘油后，大鼠脑组织及血液中的NO水平明显升高，提示偏头痛模型造模成功。白芷总香豆素、白芷挥发油、白芷总香豆素和挥发油组合物均能明显降低血和脑组织中NO水平，说明该药物对偏头痛起到了预防作用。
CGRP是含有37个氨基酸残基的一种多肽，是体内最强的舒血管活性物质，在偏头痛发作过程中发挥重要作用，被认为是偏头痛治疗的新靶点[20]。偏头痛发作时CGRP被大量释放并对机体产生如下影响：①促进感觉神经传导并扩张血管，活化CGRP受体；②介导肥大细胞脱颗粒并释放多种活性物质；③参与三叉神经脊束核内的伤害感受器的二级神经元，影响伤害性感受信号的传递；④三叉神经节内的胶质细胞里面含有大量CGRP 受体，可直接合成CGRP，刺激胶质细胞分泌出炎症因子及NO，而NO可进一步释放CGRP，兴奋邻近神经元及神经胶质细胞[21-22]。临床上有效的抗偏头痛药物，如麦角胺类药物、舒马曲坦等，均能明显抑制偏头痛患者或偏头痛模型动物血浆中CGRP水平升高[7,23]。 本研究中，注射硝酸甘油后，大鼠血浆中CGRP水平明显升高，提示偏头痛模型造模成功。给予白芷挥发油、白芷香豆素与挥发油组合物(50和100 mg·kg-1)治疗的大鼠血浆中CGRP水平明显降低，可认为其有预防偏头痛的作用。白芷香豆素、白芷香豆素和挥发油组合物(25 mg·kg-1)尽管也可以降低CGRP水平，但与偏头痛模型组比较作用效果不显著，这可能与用药剂量较低有关。
ET是一种具有强烈收缩血管作用的血管活性多肽，是头痛和大脑局部缺血的主要因素[24]。偏头痛发作时，血浆中ET水平升高，多条细胞信号通路被激活，支配血管的活性物质释放或降解失衡，引起血管舒缩功能障碍，脑血管痉挛，导致头痛发作[25]。本研究中，注射硝酸甘油后，大鼠血浆中的CGRP水平明显升高，提示偏头痛模型造模成功。给予白芷挥发油(100 mg·kg-1)、白芷香豆素与挥发油组合物(100 mg·kg-1)的大鼠血浆中ET水平明显降低，提示药物发挥预防偏头痛的作用与调节体内血管活性肽的平衡有关。白芷香豆素组及白芷香豆素挥发油组合物(25和50 mg·kg-1)作用效果不明显，这可能与用药剂量较低有关。
综上所述，白芷总香豆素和挥发油合用(100 mg·kg-1)对硝酸甘油诱导的大鼠偏头痛具有明显预防作用，其效果优于单独应用白芷香豆素和白芷挥发油。白芷挥发油单用效果优于白芷香豆素。白芷香豆素和白芷挥发油预防大鼠偏头痛的作用机制可能是降低血中CGRP、NO 及ET水平，恢复血管活性物质的平衡，从而降低血管和神经的进一步损伤，减轻神经源性炎症。白芷的2种主要成分总香豆素和挥发油有协同预防偏头痛作用。本研究结果为白芷的进一步开发利用奠定了理论基础。
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