乌饭树果实提取物抗氧化活性研究

（赣南师范大学 生命与环境科学学院，江西 赣州 341000）

乌饭树（又名南烛）Vaccinium bracteatumThunb.是杜鹃花科Ericaceae越桔属Vaccinium的常绿灌木植物，目前仍处于野生状态，主要广泛分布于中国亚热带丘陵低山地区，包括台湾省和华东、华中、华南和西南等地区，也是酸性土壤的指示植物。乌饭树与蓝莓是同一个属的植物[1-2]，都属于小浆果类；乌饭树的果实酸甜可口，风味尤佳。我国民间用乌饭树嫩叶水浸提液煮熟的米饭呈紫黑色，故称其为“乌饭”，这是我国几千年的传统保健食品[3-4]。乌饭树叶具有较强的清除氧自由基和清除羟自由基活性[5-8]，现代医学和食品科学等学科关于乌饭树叶的抗氧化活性物质的研究较多。魏国华等研究认为，乌饭树叶富含浓缩型单宁、槲皮素等多酚类化合物[9-10]。这些酚类化合物具有较强的抗氧化功能，可清除羟自由基（DPPH）和氧自由基（-OH-）[11-12]，因为当DPPH溶液中加入自由基清除剂（抗氧化物质）时，DPPH加入自由基接受受试物的电子或者氢自由基而变成稳定的抗磁分子[13-14]。其次，在抗脂质过氧化的研究中发现，脂质一旦被氧化，就会产生脂质过氧化自由基，由此又影响到周围的脂肪酸并产生新的脂质自由基，如此连锁反应会持续下去，从而破坏细胞膜的脂质结构，甚至损坏蛋白质和核酸，导致细胞和组织病变。凌关庭等认为，抑制脂质过氧化的能力主要取决于“抗氧化物质”本身提供H＋的能力，乌饭叶的提取物（主要是多酚类抗氧化物质）都具有抗脂质自由基的能力[13-14]。因此，乌饭树叶具有较强的抗疲劳及延缓衰老、抗贫血及增强机体免疫力、抗癌防癌、改善视网膜功能、治疗糖尿病等功用[15-17]。但是，目前关于乌饭树果实抗氧化物质及其抗氧化活性的研究报道较少。为给其功能性品种的进一步选育和有效利用打下理论基础，对乌饭树果实中抗氧化物质的提取、含量及抗氧化活性等方面进行了实验研究，同时对不同地理区域的乌饭树果实其抗氧化能力的地理差异进行了比较分析，现将研究结果分析报道如下。

1 取样及样地的自然条件

在江西的赣州和萍乡、湖南浏阳、江苏宜兴4个地点采集成熟的乌饭树果实，每个地点各选取5个居群采样，混合后称取600 g作为这个采样地点的测试样品，取样地点的自然条件见表1。在测试实验过程中，每个地点的样品重复测试2次。

表1 乌饭树果实取样地点及其自然地理气候因子Table 1 Climates of geographic areas where samples of fruits were taken

2 测定方法

2.1 仪器与试剂

主要仪器为岛津LC-10A高效液相色谱仪，DGU-14A 脱气机，LC-10AT 二元泵，SIL-10AD自动进样器，SPD-10AZ紫外检测器，KQ-250DE数控超声波清洗器、WP-UP-IV-20沃特浦超纯水机、紫外可见光分光光度计UV2550。

主要试剂有无水乙醇、乙醇和甲醇，槲皮素对照品（批号为100081-20108）、木犀草素对照品（批号为111520-200504）、维生素C对照品（100425-201103），均购于中国药品生物制品检定研究院，DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苦肼）购于美国sigma公司。

2.2 测定方法

2.2.1 以水和乙醇为溶剂的提取方法

取表1中4个地点的样品混合后随机抽取200 g的乌饭鲜果阴干、粉碎，过3号筛。分别精确称取粉末约0.2 g各置于3个三角瓶中，再分别加入水、95%乙醇、60%乙醇各25 mL，超声处理（功率250 W，频率30 KHZ）30 min，滤过后得到供试样品液。然后取各供试样品溶液加入试管中，加入1×10-4mol/L的LDPPH.溶液2 mL，密闭放置30 min，以无水乙醇溶液为空白，在517 nm处测定其吸光度（A2）；又取各供试品溶液加入试管中，加入无水乙醇溶液2 mL，也以无水乙醇溶液为空白，在517 nm处测定其吸光度（A0）；再取无水乙醇溶液加入试管中，加入1×10-4mol/L DPPH.溶液2 mL，以无水乙醇溶液为空白，在517 nm处测定其吸光度（A1）。计算其对 DPPH的抑制率，其计算式如下：

2.2.2 不同浓度提取液清除DPPH.自由基活性的测定方法

从采自赣州峰山编号为GF的样品中随机抽取200 g的乌饭鲜果阴干、粉碎，过3号筛，取粉末约0.2 g置于三角瓶中，分别加入水和60%乙醇，每次 25 mL，超声处理2次，每次处理30 min，滤过后合并滤液，即得水提取液和60%乙醇提取液。配置DPPH溶液，即称取1.18 mg的DPPH置于三角瓶中，加入无水乙醇溶液30 mL使其溶解，制成1×10-4mol/L的溶液，然后进行不同浓度提取液清除DPPH自由基活性的测定。不同产地的样品其测定方法均与此相同。

2.2.3 槲皮素含量的测定

乌饭果实中的抗氧化物质主要是槲皮素[18-19]，其测定方法如下：取不同地点的鲜果样品阴干，粉碎后过3号筛以备用；取其粉0.5 g，加入甲醇∶盐酸为10∶1的混合溶液25 mL，静置30 min；放于60 ℃的水浴中超声（200 W，40 kHz）1 h，滤液过0.45 μm的微孔滤膜，即得供试样品溶液。色谱柱为Agilent Zorbax-SB C18（4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇∶0.2%磷酸溶液（55∶45），流速为1.0 mL·min-1，检测波长360 nm，进样量10 μL，柱温25 ℃。又取槲皮素对照品4.805 mg，置入10 mL的量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度即得对照品溶液。取不同地点的样品制备溶液，进样10 μL，分别测定峰面积，计算槲皮素含量。

3 结果与分析

3.1 不同溶剂的提取效果

分别以水和不同浓度的乙醇为溶剂提取乌饭树果实（样品编号为GF，重复3次，即n＝3），其水、60%乙醇、95%乙醇提取液对DPPH自由基的抑制率分别为94.10%、98.31%和97.57%；乙醇提取液的清除率（抑制率）略高于水提取液的清除率，但两者都超过了90%，两者间没有显著性差异（见表2）。考虑到乌饭树果实的最大实用价值是用作保健食品，因此，以水为溶剂提取其抗氧化物质并进行开发利用，具有可靠的安全性和优势。

表2 乌饭树果实不同溶剂的提取液对DPPH自由基的清除率Table 2 Clearance rate of DPPH.free radical of extracts in different solvents from Vaccinium bracteatum fruits

3.2 不同浓度提取液抑制DPPH自由基的活性

DPPH自由基是一种以氮为中心的很稳定的自由基，常用于测定抗氧化物质的抗氧化活性，若受试物能够清除它，则表示受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或者过氧自由基的能力或打断脂质过氧化链反应的作用即抗脂质氧化的作用[13-14]。其对DPPH的清除率越大，说明其抗氧化性越强。本文选用赣州峰山样品（GF）进行测定（n＝3），得到的不同浓度提取液抑制DPPH自由基的效果如表3。由表3可知，60%乙醇提取液的抗氧化性最强，而水提取液的安全性较好，因此采用水和60%乙醇提取液比较分析了不同浓度提取液抑制DPPH自由基活性的效果。

表3 乌饭果实水和60%乙醇的提取液及Vc对DPPH的清除率Table 3 Comparison of clearance rate of DPPH between aqueous and 60% ethanol extracts of Vaccinium bracteatum fruits,and the rate of Vc to scavenge DPPH free radical

设自由基清除率为50%时所需样品的质量浓度为IC50，IC50值越小，说明其抗氧化活性越强。表3表明，水提取液的IC50值小于60%乙醇提取液的IC50值，说明水提取液的抗氧化活性更强。其次，这两种提取液都表现为随着浓度的增加其对自由基的清除效果也相应增强，而且清除效果都达到94%以上，说明乌饭树果实具有较好的抗氧化效果。另外，水提取液对自由基的清除率达到94.68%时其所需浓度为2.06 mg·mL-1，而60%乙醇提取液对自由基的清除率达到97.44%时其所需浓度仅为1.35 mg·mL-1。这一结果表明，水提取液通过加大浓度可以获得较高的自由基清除效果，也反映了果实中可能还存在一些不溶于水而溶于60%乙醇的抗氧化成分，对此尚需进一步研究。

3.3 水提取液抗氧化活性的地理差异

不同产地的乌饭树果实样品水提取液对DPPH自由基的清除率见表4。由表4可知，IC50值最小的来自赣州峰山的样品（GF）；其他3个地区样品的IC50值相近，其平均值为0.717 mg·mL-1，这与样品 GF的 IC50值 (0.32 mg·mL-1)相差 1.2倍，IC50值越小说明其抗氧化活性越强。另外，表4中清除率较高的样品分别来自赣州峰山和萍乡。不同产地的样品其清除率从高至低依次是样品GF＞样品PX＞样品YX＞样品LY，基本上呈现出由低纬度向高纬度逐渐变小的趋势，这与乌饭树优株果实大小的地理变化规律一致[20]。基于此规律并结合IC50值的变化情况分析认为，纬度较低的赣南地区不仅是选择优良抗氧化效果的乌饭树优株的重要地区，也是选择大果型优株的重要地区。

表4 不同产地的乌饭树果实样品水提取液对DPPH自由基的清除率Table 4 Clearance rate of DPPH free radical of aqueous extract from samples of Vaccinium bracteatum fruit

3.4 水提取液中主要抗氧化物质槲皮素含量的地理差异

槲皮素是乌饭树果实中主要的抗氧化物质，而且研究结果显示，其木犀草素含量极少，因此，本文没有测定木犀草素含量。乌饭树果实槲皮素含量的地理差异情况如图1所示。图1表明，赣州峰山样品（GF）中的槲皮素含量最高（30.0 mg·g-1），是宜兴样品(YX，4.5 mg·g-1）的6.7倍，是萍乡样品（PX，7.2 mg·g-1）的4.2倍，是浏阳样品（LY，8.5 mg·g-1）的3.5倍。由于萍乡和浏阳两地果实的槲皮素含量相近，因此认为，乌饭树果实中的槲皮素含量基本呈现出从低纬度到高纬度逐渐减少的变化规律，这与其水提取液抗氧化效果的地理变化规律和优株果实大小的地理变化规律均相一致。

图1 乌饭树果实中槲皮素含量的地理差异Fig.1 Differences of Qercetin contents of Vaccinium bracteatum fruit in different geographic areas

3.5 抗氧化活性的比较

3.5.1 与VC抗氧化活性的比较

不同产地的乌饭果实都含有VC，而独立考察VC对DPPH自由基的清除效果，对于评估乌饭果实的抗氧化作用具有一定意义。称取VC10.0 mg，配成质量浓度为0.4 mg·mL-1的VC水溶液，又取此液分别加入以乙醇配成的质量浓度分别为10、20、40、60、100 和 500 μg·mL-1的 VC测定溶液；再分别取各浓度的VC测定液1 mL，都加入3 mL的DPPH溶液，30 min后于517 nm处测定其吸光度（A）并计算（n＝3），结果见表5。由表5可知，VC清除DPPH自由基的IC50值所需浓度为3.29 μg·mL-1，而乌饭树果实水提取液的 IC50值所需浓度为 0.32 mg·mL-1（320 μg·mL-1），即要清除50%的DPPH自由基，乌饭树果实水提液的用量大约是VC的97倍。这是因为，水提取液是粗提取液，因此要达到清除50%自由基的效果必然要增加用量；但乌饭树叶精提物的抗氧化效果却是VC的 1.4 倍[9]。

3.5.2 与其它果品的比较

乌饭树果实和蓝莓、苹果等果品都含有丰富的多酚类抗氧化物质。多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚性羟基成分的总称，它包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷等成分，槲皮素是黄酮类化合物的一种。本文将乌饭树叶乙醇提取物[7,23]、乌饭果实水提取物、蓝莓（果）乙醇提取物[24-25]和‘国光’苹果乙醇提取物[22]对DPPH自由基的清除效果及其抗氧化物质含量进行了比较，结果见表5。由表5可知，几种果品抗氧化物质含量的大小顺序是乌饭叶＞乌饭果＞苹果＞蓝莓；其抗氧化能力的强弱顺序也是乌饭叶＞乌饭果＞苹果＞蓝莓，这可能是我国古老的传统食品“乌饭”之所以代代相传的主要原因。但是，不同的植物果实所含的主要抗氧化成分不同，因此对不同的氧化物质的清除效果也不同，如苹果中的VC含量较高，其抗脂质氧化的效果强于乌饭树叶[21-22]，因此，富含VC的苹果、猕猴桃等在抗脂质氧化方面均有优势；其次，同一种植物不同器官的抗氧化效果不同，如乌饭叶虽然抗氧化物质含量较高，但各种色素比果实少，这正是果实具有较好的保护视网膜等功能的反映。

表5 不同果实或叶片对DPPH自由基的清除效果及其抗氧化物质含量的比较Table 5 Clearance effect of DPPH and the contents of antioxidant components of fruits or leaf

4 讨 论

4.1 提取溶剂与食品安全的关系

虽然以60%乙醇为溶剂提取乌饭果实所得的提取液对DPPH的清除率高于水提取液（表2），而水提取液的食用安全性好，这对于乌饭果实主要作为食品开发利用非常重要。但是，60%乙醇提取液可以提取到一些不溶于水的抗氧化成分，从而表现出只要较低浓度的提取液就能达到97.44%的清除率（表3）。因此，乙醇提取方法可以应用于精提某些特殊抗氧化成分，这对药品或具特殊功能的保健食品的开发具有重要价值。

4.2 乌饭树果实与叶的抗氧化效果问题

本文分析认为，乌饭树叶与果实的抗氧化物质含量从大到小依次是乌饭叶＞乌饭果，其抗氧化能力也是乌饭叶＞乌饭果；其次，乌饭叶比果的资源培育更简便，因此有利于形成以乌饭叶为基础的产业技术开发，促进区域经济发展。但是，乌饭果含有丰富的不同类型的天然色素和花色苷，这在保护视网膜和清除肝细胞自由基等方面具有特殊的意义[17]，故其作为小浆果类型乡土果树品种的选育与利用具有很大的市场前景。

4.3 品种选育与地理区域的关系

乌饭树果实抗氧化物质（槲皮素）含量、水提取液抗氧化效果以及优株果实大小都呈现出从低纬度到高纬度逐渐减少（小）的地理变化规律，这表明优良品种的选育应遵循这个规律，其中较低纬度的南岭地区（包括赣州南部）具有较高的概率发生优良植株，其原因可能是南岭地区是乌饭树自然分布区的近边缘，并且此区域地形变化多样，从而导致其生境多样化，因此有利于物种发生遗传分化和变异。

5 结 论

（1）乌饭果的水提取液对DPPH自由基的清除效果达到了94.10%，并具有较好的食用安全性。而其60%乙醇提取液中含有一些不容水的抗氧化成分，只需较低的浓度就能达到97.44%的清除率，因此，乙醇提取方法适用于精提工艺。

（2）乌饭树叶的抗氧化物质含量（槲皮素）和抗氧化能力（清除DPPH自由基）都高于乌饭果；但乌饭果含有丰富的不同类型的天然色素和花色苷，故其某些功能效果要优于叶。

（3）水提取液是粗提取液，虽然含有不同类型的抗氧化化合物，而清除DPPH自由基的能力低于精提物；另外，清除50% DPPH自由基的乌饭果实水提液的用量约为VC的97倍。

（4）乌饭树果实抗氧化物质（槲皮素）含量和水提取液抗氧化效果都呈现出地理变化规律，较低纬度的南岭地区（包括赣州南部）可发现乌饭树优良植株，因此，应该特别关注该地区对于选育优良品种的重要性。

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