拓扑替康对核干细胞因子表达的影响

蔡弘扬 王晋

摘 要：目的： 拓扑替康对核干细胞因子表达的影响；方法： 采用免疫组化方法检测NS基因及蛋白在HL-60白血病细胞中表达的影响；结果：免疫组化方法检测NS在白血病细胞中阳性表达率高。结论： NS在白血病细胞系HL-60中表达。

关键词：拓扑替康 核干细胞因子 影响

中图分类号： R-0 文獻标识码：A 文章编号：1003-9082（2018）05-0-01

拓扑替康（topotecan，TPT）以DNA拓扑异构酶Ⅰ（TopoⅠ）为作用靶点的半合成喜树碱（CPT）衍生物，是一种新药，呈水溶性，目前已广泛应用于多种实体瘤的治疗及试用于恶性血液系统疾病的治疗[1]，并取得较好疗效。研究发现拓扑替康就是一种TopoⅠ抑制剂，作用位点比较独特，拓扑异构酶是一种细胞核内酶，无多药耐药现象，有较好的选择性特点。

核干细胞因子（NS）基因[2]是一个新基因，与增殖调控功能相关，在干细胞和肿瘤细胞中常见，是一种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白， 存在于细胞核内，以三磷酸鸟苷（GTP）依赖的形式游动，主要作用是和细胞增殖相关。近年来岳保红[3]等人发现在早期多潜能状态时的细胞内核干细胞因子蛋白表达量大，如果细胞开始分化NS蛋白会表达量剧降且会很快不见。他们还发现NS蛋白参与细胞增值调控过程，提出了NS蛋白参与多种干细胞或者癌细胞自身不断更新的进度，并且使细胞停留在分化状态不再继续分化。

一、材料与方法

1.材料

1.1细胞株

人源性白血病细胞系HL-60细胞，由中国协和医科大学肿瘤研究所提供。

1.2试剂

TPT（注射用盐酸拓扑替康）。

2.方法

2.1细胞培养

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2饱和湿度下的恒温箱中进行常规培养，平均2-3天换液一次，，正常情况下细胞生长悬浮成团，大小较均一，光滑圆润，细胞膜完整，生长状态良好，取2X106的细胞进行实验。

2.2免疫组化实验步骤

根据免疫组化的实验说明。

2.2.1 免疫组化实验步骤

细胞爬片：将新的盖玻片（8*8mm）用酒精棉球擦洗净，泡酸，75%的酒精溶液中浸泡30分钟，然后取出用双蒸水洗涤几次，烘箱烘干，再用多聚赖氨酸（黏合剂）涂片，烤箱烘干，紫外消毒30分钟。消毒好的盖玻片放在90mm的培养皿中，并在次培养皿中接种细胞，细胞密度一般为2*104/ml，接种好后开始进行细胞爬片，放置在含量为5%的CO2温箱内培养，经过2-3天后即可进行免疫细胞组织化学染色鉴定。

取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗3次，每次5min，得到细胞涂片。

将细胞涂片放置在4%多聚甲醛内固定30分钟，到时间后，用蒸馏水进行冲洗，然后放置在含3%H2O2的去离子水中，室温下浸泡10分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶，以免影响后续试验。

试剂盒内取出封闭用正常山羊血清（试剂A），挤出1滴A于表面，放置室温条件下20分钟，然后轻轻甩去玻片表面多余液体。在载玻片表面滴加第一抗体（羊抗NS），放置4℃冰箱，过夜。

过夜后，取出，用PBS缓冲液冲洗，一般冲洗3次，每次冲洗5分钟。取出试剂盒内第二抗体SP-9000，试剂B，此步骤即滴加生物素标记的第二抗体，然后放置室温下，10-15分钟。

再用PBS缓冲液冲洗，共3次，每次5分钟。试剂盒内取出（试剂C），也即滴加1滴辣根酶标记链酶卵白素溶液，放置于室温下，时间为10-15分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟。滴加2滴DAB溶液（DAB溶液需要新鲜配制现配现用，放置太久失效），放在显微镜下观察，并控制显色时间。显色好后用流动的自来水冲洗载玻片，冲洗后显色反应终止。经过苏木素复染，在经过脱水﹑透明，然后封片。放置光学显微镜下观察染色结果并拍照。

2.2.2 阳性结果的判断标准

显微镜下观察，以细胞核内出现淡黄至棕黄色颗粒为阳性细胞。并在显微镜下随机计数300个细胞，以染色阳性的细胞所占的百分比值作为NS蛋白免疫组化检测的结果。并对NS蛋白表达阳性所占比例进行下列计算：

阳性细胞所占百分数=细胞阳性染色个数/300×100%。

采用文献报道的常用方法，根据阳性细胞数和着色深度计分乘积即表达强度进行评分。

癌细胞免疫组化染色着色深浅计分标准：0分为无色，l分为淡黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。

表达强度=染色深浅×阳性细胞所占百分比。≤1分的判定为表达阴性，>1判定为表达阳性。

二、结果

免疫组化结果示TPT对 HL-60细胞NS蛋白表达的影响：

HL-60细胞内加入0.4?mol/L的拓扑替康，经过36小时后，收集细胞进行免疫组化，检测到核干细胞因子蛋白在细胞中的阳性细胞百分比为5.67%，而对照组中不加拓扑替康的细胞内核干细胞因子蛋白表达阳性的细胞百分比例已达到89.67%，显然，两者相比差异具有统计学意义性（P<0.05）。（表1）。

三、讨论

拓扑替康是1996年在美国上市的半合成抗肿瘤新药，在临床上已开始使用，这种药物由Smithkline Beecham制药公司制造，供应于各地，它也是世界上第一个以拓扑异构酶Ⅰ为靶酶的抗肿瘤药物，也有国产的拓扑替康，价格也较进口便宜，但疗效较进口为差。

急性白血病 （acute leukemia） [4]是一种恶性血液系统疾病，特点是造血干细胞功能大部分丧失，细胞不断增殖克隆，白血病患者的造血干细胞和正常的造血干细胞存在类似的特点。白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病率越来越高，死亡率也很高，这就严重影响了国民健康。但是随着联合化疗的不断发展[5]，骨髓移植术的不断提高，免疫治疗及基因治疗的不断改善[5]，急性白血病的治疗效果明显得到了很大的提高。有研究报道核干细胞因子在正常造血系统的造血干细胞中发现，在成熟细胞和淋巴细胞没有发现它的踪迹；白血病细胞是些不分化的幼稚细胞，无限增殖克隆[6]，因此，NS在白血病细胞可发现，但目相关关NS在白血病细胞表达的研究不多甚至少有[7]。拓扑替康能否以抑制NS蛋白在白血病细胞中表达的方式，来阻止白血病细胞的无限克隆增殖还需进一步研究，TPT对白血病细胞的抗肿瘤作用与NS基因的表达之间是否存在相关的关系有待进一步探索。本研究应用相关分子生物学技术探讨TPT对白血病细胞诱导凋亡的作用，并检测TPT是否能够抑制白血病细胞中的核干细胞因子及其蛋白的表达使其下调，从而更深层次的明确TPT治疗白血病细胞的作用机制，为临床提供有价值的实验资料。

本研究結果显示：通过免疫组化结果显示对照组（未用TPT作用组）可见核内棕黄色着色深度深，而经过0.4?mol/L TPT作用36小时后的HL-60细胞着色深度明显变浅甚至没有着色，结果都表明TPT可以抑制白血病细胞中NS基因的表达，使之下调，推理之TPT通过抑制NS蛋白成为治疗白血病的机制之一也不为不可能。也有研究表明，NS可能在细胞周期中干细胞和癌细胞穿越G2/M调控点的决定方面是一个特异性因子，由于它仅表达于干细胞和恶性肿瘤细胞中，而白血病既是干细胞疾病又是恶性肿瘤，因此在白血病细胞中研究NS基因和NS蛋白也比较合适，而TPT是Topo-Ⅰ的抑制剂，具有广谱抗肿瘤作用，其作用机制也并不十分完全明了，因此，TPT有可能通过下调NS基因而达到抗白血病作用可能为其作用机制之一。

TPT可以通过抑制HL-60细胞中NS蛋白的表达，并且也可能是通过抑制NS基因的表达，使NS基因表达下调，从而导致细胞离开细胞增殖周期而不断发生分化，使白血病细胞发生凋亡而达到抗肿瘤作用。

参考文献

[1]刘庭波，吕联煌.c-myc反义寡脱氧核苷酸诱导人髓系白血病细胞系HL-60细胞凋亡.中国实验血液学杂志，2001，9（1）：34-38

[2]张志宏；刘思金；等；RNA干扰抑制膀胱肿瘤细胞BIU-87核干细胞因子基因表达对其增殖的影响[J]；中华泌尿外科杂志；2006，S1：28-29

[3]岳保红，孙玲等.核干细胞因子基因在急性白血病细胞表达的检测和意义[J]，中华检验医学杂志，2006，29（4）：324

[4]Joan C.Ritland Politz， Ilvin Polena， Ian Trask，et al A Nonribosomal Landscape in the Nucleolus Revealed by the Stem Cell Protein NS.Molecular Biology of the cell.2005，16：3401-3410.

[5]Tsai RY，Mckay RD.A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev， 2002， 16（23）：2991-3003.

[6]Joan C.Ritland Politz， Ilvin Polena， Ian Trask，et al A Nonribosomal Landscape in the Nucleolus Revealed by the Stem Cell Protein NS.Molecular Biology of the cell.2005，16：3388-3396.

[7]Liu S，J，CaiZW，Liu Y，J，et al， Role of nucleostemin in growth regulation of gastric cancer，liver cancer，liver cancer and other rnalignancies[J].World J Gastroenterol，2004，10（9）：1246-1249.