长寿老人源降胆固醇乳酸菌的分离鉴定及生化特性研究

玉力吐孜·迪力木腊提 努尔哈提·斯拉甫尔 乌斯满·依米提

摘 要：【目的】分离纯化新疆喀什维吾尔族长寿老人肠道中的降胆固醇乳酸菌及其生物学特性研究。【方法】通过平板分离法从喀什维吾尔族长寿老人肠道中共分离获得降胆固醇候选菌株10株，并采用硫酸铁铵法测定菌株对选择性培养基中胆固醇的脱除率，并进行了16SrDNA测序和分子鉴定。 【结果】筛选出的10株实验菌株均能从培养基中除去胆固醇，去除率都大于60%，经过分子鉴定为乳酸菌，都属于肠球菌。其中筛选出3株调节能力较强的候选菌（R08-37，R05-24，R02-6）。表明这些菌株对人类的长寿能起到一定的作用。

关键词：喀什 长寿老人肠道 降胆固醇 乳酸菌

中图分类号：Q93-31 文献标识码：A 文章编号：1003-9082 （2018）05-0-02

目前，新疆南疆地区是我国正式命名的7大“长寿地区”之一[1]。研究者曾经对我国著名的长寿地区进行多次调查和研究总结出的长寿因素有基因遗传[2]、气候条件、环境因素[3]、合理饮食结构、居住环境[4]等等，而长期忽略了人类共生微生物。近几十年以来国内外研究表明[5-7]，共生微生物也有较强的降胆固醇功能。

乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，除了在调节胃肠道微生态平衡、提高免疫系统功能起着重要的作用[8]以外还具有降低食物及人体血清中胆固醇含量的作用。

本研究首次我国喀什地区90岁以上维吾尔族长寿老人粪便为实验材料，筛选出具有降胆固醇、对胆盐及酸有较强的耐受性的乳酸菌，为食品、药品等行业提供优良菌种。

一、材料与方法

1.材料

样品来源：从新疆喀什地区采集16位维吾尔族人粪便样品（男性8名，女性8名），90～102岁；所有采样对象在被采样前至少两个星期内未服用任何含有活菌的发酵食品、未服用任何种类的抗生素类药物。

主要试剂：改良的MRS+CaCO3固体培养基、MRS液体培养基、浓度为0.1mg/mL 的高胆固醇MRS-CHOL选择性培养基[9]；细菌基因组DNA提取试剂盒、溶菌酶、Tag聚合酶等。

2.方法

2.1 乳酸菌的分离、纯化

将长寿老人粪便样品进行梯度稀释至10-4，10-5和10-6，在经过灭菌并冷却到45～50℃的改良MRS+CaCO3琼脂培养基上涂布，37℃厌氧培养24-36h，挑取菌落比较大、有透明圈的菌落，进行纯化处理，之后置于甘油中存储。

2.2 菌株形态观察

对分离得到的菌株进行菌落形态观察、革兰氏染色，并进行镜检[10]。

2.3 体外胆固醇能力的测定

运用硫酸铁铵法[11]对胆固醇含量进行测定，且绘制出相应的标准曲线。

胆固醇的调节率/%=（C-A）/C╳100%

其中A指的是各实验菌株发酵后的选择培养液OD620nm； C指的是空白对照的OD620nm。

2.4 菌株鉴定

2.4.1 菌株属的鉴定：对筛选出的革兰氏阳性菌菌株实施生化特性测定，主要涉及硫化氢产生试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖产酸产气试验、半乳糖试验、45℃生长试验，pH4.5生长试验等。

2.4.2 菌株16S rDNA序列鉴定：对菌液进行活化处理，采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒进行提取。将细菌DNA作为基础，采用27F（5-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3）、1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）实施PCR扩增，采用1.0%琼脂凝胶电泳对扩增产物进行检测，正确的扩增子则委托生物工程（上海）股份有限公司实施DNA测序。将最终结果提交NCBI基因库，实施Blast比对分析。

2.5 分析

试验数据经过Excel（2010）进行初步统计，所有的数据均重复三次，每次实验均做平行实验，实验结果表示为均值±标准偏差（X ±SD）。应用SPSS（19.0）软件对实验数据进行统计学分析。数据间的比较采用独立样本T检验（Independent-Samples T test）、单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较进行分析。P<0.05表示差异显著有统计学意义。

二、结果与分析

1.菌株的分离、纯化

通过分离获取人源乳酸菌10株，经革兰氏染色表现为阳性。

2.体外检测胆固醇含量

将胆固醇质量浓度（mg/mL）作为横坐标，将620nm下的吸光度值作为纵坐标，做出标准曲线，如图1所示，可得拟合直线方程为：y=0.5308x+0.001，该方程的R2=0.9941，存在较高的拟合度，表明此直线方程可作为标准曲线。

3.人源乳酸菌调节能力测定

对从采集的8份样品（长寿组）中分离获得的10株菌株进行体外降胆固醇能力以及各菌株对胆固醇的去除率的测定，10株调节率≥60%的乳酸菌（表1）

由表可知，对胆固醇调节能力的测定结果显示，菌株R08-37的调节能力最高，对应的调节胆固醇的量为52.75ug/mL。

4.候选菌株的生化鉴定和16SrDNA测序结果

已分离的10株乳酸菌均为革兰氏染色阳性，吲哚实验、硫化氢实验、葡萄糖产酸产气试验、半乳糖试验等均表现为阴性，于15℃、45℃环境下能够生长，于60℃環境下不可生长；可耐受6.5%NaCl，可于pH9.6环境下生长，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》，继而判断为肠球菌属。

5.菌株16SrDNA鉴定及系统发育树

采用MEGA6.0构建系统发育树，系统发育树见图3。

从图中可知，RO1-1HQ603859、RO1-2HQ603858、R02-6（JF896442）、R02-7（JF896442）、R04-20（DQ411813）为Enteroco durans的不同变异品系；R05-21（AF539705）、R05-22（AJ306297）、R05-23（HM443954）均为Enterococcus faecium的不同变异品系；R05-24（D16552）、R08-37（AF469172）为Lactobacillus plantanum的不同变异品系。

将10株候选菌株目的片段委托生物工程（上海）生物科技有限公司测序后，提交NCBI进行Blast比对结果显示均为肠球菌。

三、讨论

由表1可以得知已筛选分离纯化的39株人源乳酸菌都能调节培养基中的胆固醇，其中筛选出10株调节胆固醇能力高于60%的候选菌株。郭钦【12】、温子辉【13】、彭灿【14】、吕秀红【15】研究的食品源乳酸菌的降胆固醇率分别达到30.9%、52.2%、69%，50.03%。本实验的结果符合常规，也具有很大的优势。

筛选出的乳酸菌除了具备降胆固醇功能外，还应考虑到其他方面的功能。在本实验中，所选取的菌株不仅要具有降胆固醇活性，而且生长范围均比较广（15℃～45℃）、耐pH9.6、耐盐（6.5%），有较强的肠道胆盐环境耐受性，具有菌株特异性。

综上所述，乳酸菌的去除胆固醇能力、低pH的耐受性并无明显相关性，菌株之间存在差异性。在本研究中，所筛选出的三株菌株具有进一步深入研究的价值，继而为乳酸菌和长寿的关系研究奠定基础。

参考文献

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[15]吕秀红， 陈凯飞， 朱祺， 等. 降胆固醇乳酸菌的筛选与鉴定[J]. 中国食品科学报， 2016 16（3）：198-201

作者简介：玉力吐孜·迪力木腊提（1990.2.1-），女，维吾尔族，硕士，研究方向：微生物资源开发。

通讯作者：乌斯满·依米提，男，维吾尔族，副教授，博士，研究方向：微生物资源与开发。