甘薯IbGL3的克隆和表达分析

徐靖 朱红林 朱家红 符策强 韩义胜 唐力琼 王敏芬 王新华 王效宁

摘 要：紫色甘薯富含花青素，具有较高的食用和药用价值。花青素的生物合成受到结构基因和调节基因的控制。bHLH（basic helix-loop-helix protein）转录因子能够调节多个花青素结构基因的表达，在花青素生物合成途径中具有重要的调控作用，但目前在甘薯中还没有关于bHLH调控花青素生物合成的相关报道。

为进一步了解IbGL3基因在甘薯花青素生物合成的功能和作用机理，该研究根据甘薯转录组数据，利用RT-PCR技术在甘薯中克隆了一个2 120 bp的bHLH基因IbGL3，该基因包含一个1 878 bp的开放阅读框，编码625个氨基酸，蛋白质分子量69.08 kD，理论等电点（pI）5.20。IbGL3蛋白和其他植物中类黄酮合成相关的bHLH蛋白具有较高的同源性，都包含保守的MIR区、bHLH结构域和ACT类似结构域。系统发育进化树分析结果显示，IbGL3与其他植物类黄酮相关bHLH蛋白聚为一类，属于Ⅲf 亚类成员。表达结果显示，IbGL3基因在紫色甘薯中的表达量最高，在浅紫色甘薯中的表达量次之，在白色甘薯中表达量最低，与花青素积累正相关，因此推测其在甘薯花青素生物合成途径中具有重要的调控作用。

关键词：甘薯，花青素，bHLH转录因子，基因表达

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）10-1356-07

Abstract：Anthocyanin-rich purple sweet potatos have high edible and medicinal values. Anthocyanin biosynthesis is controlled by structural genes and regulatory genes. The basic helix-loop-helix protein（bHLH ） transcription factor plays an important role in anthocyanin biosynthesis by regulating multiple structural genes. However，there are no reports about bHLH regulating anthocyanin biosynthesis in sweet potato. In order to further understand the function and molecular mechanism of IbGL3 in the biosynthesis of anthocyanins in sweet potato，in this study，a bHLH gene named IbGL3 was cloned in Ipomoea batatas based on transcriptome data and RT-PCR technology. The full-length cDNA of IbGL3 was 2 120 bp，containing 1 878 bp opening reading frame（ORF），and encoding 625 amino acids. The encoded protein of IbGL3 has a molecular weight of 69.08 kD and the theoretical isoelectric point（pI） of 5.20. The IbGL3 protein had highly conserved MIR motif，bHLH domain and ACT domain，shared high identities and similar domains with bHLH proteins involved in anthocyanin biosynthesis from other plants. Phylogenetic analysis showed that IbGL3 was clustered in the Ⅲ f bHLH subgroup together with other anthocyanin-related bHLH proteins. The expression of IbGL3 in the storage root of different sweet potato varieties was detected by quantitative polymerase chain reaction（qPCR）. The results indicated that IbGL3 was mainly expressed in purple-fleshed sweet potato，followed by light purple-fleshed sweet potato and weakly expressed in white-fleshed sweet potato，and its expression was positively related to the accumulation of anthocyanin Ipomoea batatas. The results showed that IbGL3 may be involved in regulating anthocyanin biosynthesis in Ipomoea batatas.

Key words：Ipomoea batatas，anthocyanin，bHLH transcription factor，gene expression

花青素是一種存在于植物体内的类黄酮化合物，不仅在植物的花着色、抵御紫外线伤害、防止病源微生物侵袭等过程中起决定作用，还具有重要的营养价值和医疗保健功效（Panche et al，2016; Lila，2008）。花青素生物合成途径在模式植物中已得到广泛研究，相关基因已在多种植物中得到分离（Hichri et al，2011; Albert et al，2014; Wang et al，2015）。植物类花青素生物合成主要受两类基因控制：一类是结构基因，编码与类黄酮生物合成有关的各种酶类;另一类是调节基因，其编码的转录因子通过调控多个结构基因的表达参与对类黄酮次生代谢的调控（Hichri et al，2011; Wang et al，2015）。研究证实，花青素的生物合成主要受到转录因子MYB、bHLH和WD40组成的MYB-bHLH-WD40（MBW）转录复合体的调控（Xu et al，2015）。bHLH 转录因子是一类含有basichelix-loop-helix（bHLH） 结构域的转录因子，根据结构特征可分为12个亚类（I-Ⅻ），而调控类黄酮生物合成的bHLH蛋白主要集中在Ⅲf 亚类（Xu et al，2015; Heim et al，2003）。拟南芥中与调控花青素生物相关的bHLH转录因子主要有TT8/AtbHLH42、GL3/AtbHLH1和 EGL3/ AtbHLH2（Gonzalez et al，2008）。首个调控花青素生物合成的bHLH基因在玉米中得到分离和鉴定（Chandler et al，1989）。目前，已在菊花（Chrysan themums）、苹果（Malus domestica）和荔枝（Litchi chinensis）等多种植物中得到分离和鉴定，这些转录因子大都能激活多个类黄酮生物合成关键酶基因的表达（Xiang et al，2015; Xu et al，2017; Lai et al，2016）。

甘薯是世界上广泛种植的粮食和经济作物（Hu et al，2016）。作为一种联合国粮食农业组织推荐的健康食品，甘薯富含淀粉、纤维素及多种有益的次生代谢物，如β胡萝卜素和花青素（Liu et al，2017）。不同的甘薯品种中，紫肉甘薯富含的花青素，具有较高的食用和药用价值（Li et al，2013）。相对于模式植物而言，甘薯花青素生物合成和调控机理研究相对滞后，目前还没有关于bHLH蛋白调控花青素生物合成的相关报道（李霞等，2014）。在先前的研究中，笔者通过对不同肉色甘薯品种进行了比较转录组学分析，筛选到一批与花青素积累相关的差异表达基因，获得1条与其它植物中GL3高度同源的EST序列。本研究将克隆IbGL3基因，并对其进行生物信息学分析，检测其表达特征与花青素积累的相关性，为进一步揭示该基因在甘薯花青素生物合成中的功能和作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的甘薯材料种植于海南农业科学院永发基地。选取种植5个月后生长发育基本一致的白色、浅紫色和紫色甘薯品种的新鲜块根为实验材料用于RNA提取和花青素的测定。

1.2 花青素提取和测定

采用1%盐酸溶液作为提取液提取甘薯块根花青素，采用分光光度法测定花青素含量，具体参考刘桂玲等（2007）的方法。

1.3 核酸提取和cDNA的合成

甘薯块根中RNA提取采用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒;按照Thermo Scientific First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书将RNA反转录合成cDNA第一链。

1.4 基因克隆和序列分析

根据转录组数据中注释为GL3的EST序列，设计5′端特异引物PGL3F：5′-GCCCAGTTTGTTCAAGAGCC-3′和5′端引物PGL3R：5′-AGTTAGGGATAAACCTTTGCT-3′，以甘薯cDNA为模板对IbGL3进行扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的条带与pMD19-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定阳性克隆，送诺赛基因公司测序。利用ExPASy在线软件（https：//www.expasy.org/）分析预测蛋白的氨基酸组成、分子式、分子量、等电点、稳定性和亲水性等;利用PSORT（http：//psort1.hgc.jp/form.html）预测亚细胞定位;利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽分析;利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构;利用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对分析;利用MEGA7进行进化树分析。

1.5 基因表达分析

利用SYBR Select Master Mix试剂盒在Mx3005P Real-Time PCR System上进行qPCR分析。内参基因为Actin，引物序列为ACT-F（5′-CTGGTGTTATGGTTGGGATGG-3′）和ACT-R（5′-GGGGTGCCTCGGTAAGAAG-3′）;目的基因引物GE3-F（5′-CATCTGGACTGCGAAACTATCC-3′）和GE3-R（5′-GCTGGTGATGGTGACGTTAAT-3′）。qPCR反应体积20 μL：10 μL 2×SYBR mix，正反向引物各1 μL（10 μmol·L-1），1 μL cDNA模板，7 μL ddH2O。 qPCR反应条件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。

2 结果与分析

2.1 IbGL3的克隆

根据在甘薯转录组数据中获得的IbGL3基因的EST序列，设计特异引物对该基因的全长序列进行扩增，获得一条2 100 bp左右的特异条带（图1）。将目的片段连接到T载体上进行测序，测序结果与通过转录组测序得到结果一致，将该基因命名为IbGL3。本研究获得的IbGL3基因全长2 120 bp，包含一个1 878 bp完整的开放阅读框。

2.2 IbGL3的分子特征

IbGL3编码蛋白由625个氨基酸组成，其中丝氨酸（Ser）最多，有63个，占比达到10.1%。IbGL3蛋白分子式为C2982H4784N854O982S24，预测分子量为69.08 kD，理论等电点5.20，不稳定系数为43.06，被归类为不稳定蛋白;總平均疏水指数为-0.555，属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示IbGL3定位在细胞核内的可能性最大，核定位信号（PSSKKRKASKT）位于C-端。信号肽分析显示IbGL3蛋白没有信号肽，不属于分泌蛋白。跨膜结构域分析显示IbGL3蛋白无跨膜结构域。

2.3 IbGL3的进化和同源性分析

为进一步了解IbGL3的功能和进化特征，将IbGL3氨基酸序列与拟南芥不同亚类的bHLH蛋白及其他植物中已鉴定的与花青素合成相关的bHLH蛋白一起聚类分析，结果显示IbGL3与TT8、GL3和EGL3聚在一起，属于Ⅲf 亚类成员（图2）。目前，在不同植物中鉴定的调控花青素生物合成的bHLH蛋白大都属于Ⅲf 亚类，这说明IbGL3可能具有调控甘薯花青素生物合成的功能。将IbGL3和其他调控花青素的bHLH蛋白进行序列比对，发现这些蛋白都包含3个保守的结构域：N端与MYB蛋白互作的MIR区、bHLH结构域和位于C端的ACT类似结构域（图3）。

2.4 IbGL3表达与花青素积累的相关性分析

利用定量PCR技术检测了IbGL3在不同肉色甘薯块根中的表达特征，发现IbGL3在紫色甘薯中的表达量最高，在浅紫甘薯中的表达量次之，在白色甘薯中表达量最低，与甘薯花青素含量正相关（图4）。

3 讨论与结论

bHLH转录因子是一类真核生物中存在最广泛的一大类转录因子，在植物细胞大小和命运调控、激素响应、金属体内平衡、光形态发生和花器官发育等多种生理过程中具有重要的调控作用（Heim et al，2003; Feller et al，2011; Yang et al，2017）。调节花青素生物合成的bHLH转录因子大都属于Ⅲf 亚类，通过改变或过表达花青素合成相关bHLH基因能够影响植物体内花青素的积累（Xu et al，2015;Li et al，2016; Lim et al，2017）。本研究在甘薯中克隆一个编码bHLH与拟南芥GL3同源的基因IbGL3，其编码区全长为1 878 bp，编码625个氨基酸。亚细胞定位预测显示，IbGL3 蛋白定位在细胞核内，说明IbGL3在细胞核内发挥功能。进化分析显示，IbGL3属于Ⅲf亚族的bHLH转录因子，与其他植物中花青素合成相关的bHLH蛋白具有较高的同源性，都含有保守的MIR区、bHLH结构域和ACT结构域。bHLH 转录因子通常与MYB转录因子相互作用协同调控花青素的生物合成，MIR区是bHLH与MYB蛋白互作区位于bHLH的N端（Heim et al，2003; Feller et al，2011）。bHLH结构域是DNA结合结构域，能形成同源或异源二聚体，这是bHLH蛋白与DNA结合的前提（Heim et al，2003; Feller et al，2011）。ACT类似结构域位于C端，是一段富含酸性氨基酸的序列，该区域能够与RNA聚合酶Ⅱ结合并启动转录;此外，该区域也与bHLH二聚体的形成有关（Feller et al，2006）。功能预测分析表明IbGL3可能具有调控甘薯花青素生物合成的功能。表达分析显示，IbGL3在紫色甘薯中大量表达，在浅紫色甘薯中的表达量次之，而在白色甘薯中表达量最低，与花青素积累正相关，进一步说明IbGL3可能是甘薯花青素生物合成的调控基因。下一步将进一步研究IbGL3在花青素生物合成中的生物学功能和调控机理，为甘薯花青素生物合成遗传改良奠定基础。