利水通窍汤对急性分泌性中耳炎大鼠VEGF表达的影响

李兰芳，于娟

1.广东省中医院耳鼻喉科，广东 广州 510120；2.广东省中医院中心实验室，广东 广州 510120

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选择健康雄性SD大鼠46只，体质量180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：44002100006305。实验在广东省中医院中心实验室进行，实验室是SPF级。将实验动物按体质量从小到大编号，随机分为头孢克洛组、模型组、利水通窍汤低剂量组、利水通窍汤中剂量组、利水通窍汤高剂量组各8只，正常对照组6只。实验中头孢克洛组死亡1只、利水通窍汤低剂量组死亡2只、中剂量组死亡1只。

1.2 主要药物与试剂 利水通窍汤药物组成：茯苓20 g，路路通18 g，黄芩、金银花、泽泻、桑白皮各15 g，柴胡、石菖蒲各12 g，川芎、地龙、车前子、桔梗各10 g，甘草6 g，中药材购自广东省中医院，然后由制剂室制成水煎剂(高剂量组1.5 g/mL、中剂量组1 g/mL、低剂量组0.5 g/mL)。绿脓杆菌内毒素，购自Sigma公司，批号：084M4013；头孢克洛缓释片，礼莱苏州制药有限公司，批号061008；抗VEGF抗体，Boster公司，批号：AR1010。

1.3 动物模型建立 全部大鼠在电耳镜下检查排除外耳道及中耳感染。除正常对照组外，其它各组大鼠按参考文献[10]的方法，沿下颌骨边缘分离肌肉，下方可见听泡，听泡内注入内毒素建立急性分泌性中耳炎大鼠模型。48 h后电耳镜观察鼓膜。

1.4 动物模型判断标准 正常对照组大鼠鼓膜透亮，鼓室无积液，锤骨柄和光锥清晰，造模后大鼠的鼓膜充血、浑浊，可有鼓室积液征，光锥消失。

1.5 干预方法 48 h后经电耳镜观察证实造模成功后，头孢克洛组、利水通窍汤各剂量组按每天1次灌胃给药。利水通窍汤高、中、低剂量组灌胃利水通窍汤的浓度分别是1.5、1、0.5 g/mL，按每只大鼠1.05 mL/100 g灌胃；头孢克洛组(头孢克洛配置成0.01 g/mL的浓度)按1 mL/100 g灌胃，正常对照组和模型组灌胃等量的生理盐水，连续给药7天。

1.6 苏木素-伊红染色（HE） 检查听泡 给药结束后全部大鼠立即断头，解剖听泡，10%甲醛固定，5%硝酸水溶液脱钙，脱水后石蜡包埋切片，HE染色，进行光镜检查。

1.7 免疫组化检查VEGF表达 取大鼠中耳部位组织，脱水包埋切片后，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，BSA或者血清封闭，加一抗、加二抗，DAB显色，复染细胞核，脱水封片，显微镜镜检，图像采集分析。Image pro-plus 6.0软件分析免疫组化图片：每组内每张切片随机挑选3个视野，200倍进行拍照，图像采集系统型号：Nikon eclipse CI。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)，以平均光密度值(OD)进行各组的比较。

1.8 中性粒细胞计数与鼓室黏膜厚度测量 取大鼠中耳黏膜部位，中性粒细胞计数：目镜上配计数格，在低倍镜下于中耳黏膜下选取5个阳性细胞多的区域，在400倍镜下计数中性粒细胞数，取5个高倍视野下的均值。

鼓室黏膜厚度：用测微计在光镜下测量，每个标本取5个不同位置进行测量并取均值。

1.9 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行分析，计量资料以(±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠鼓室黏膜病理改变比较 见图1。正常对照组：鼓室黏膜为单层上皮细胞，无明显破坏，无明显炎症反应。模型组：黏膜纤毛上皮水肿，伴少量淋巴细胞浸润，黏膜纤毛脱落，黏膜下层轻度水肿伴中等数量的炎性细胞(淋巴细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞)浸润。利水通窍汤低、中、高剂量组及头孢克洛组：黏膜纤毛上皮水肿，部分细胞气球样变，伴少量淋巴细胞浸润，黏膜下层轻度水肿伴少量淋巴细胞浸润，4个治疗组鼓室黏膜厚度、黏膜下层水肿程度较模型组轻。

图1 各组大鼠鼓室黏膜HE染色结果 (×200)

2.2 各组大鼠中耳鼓室黏膜厚度比较 见表1。与正常对照组比较，模型组大鼠中耳鼓室黏膜厚度显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，利水通窍汤低、中、高剂量组和头孢克洛组大鼠中耳鼓室黏膜厚度显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。利水通窍汤各剂量组与头孢克洛组比较无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各组大鼠中耳鼓室黏膜厚度比较(±s)

表1 各组大鼠中耳鼓室黏膜厚度比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常对照组模型组利水通窍汤低剂量组利水通窍汤中剂量组利水通窍汤高剂量组头孢克洛组n 6 8 6 7 8 7鼓室黏膜厚度(μm)41.30±8.59 158.18±9.27①125.53±6.75②128.52±9.57②111.22±9.06②111.55±9.90②

2.3 各组大鼠中耳黏膜中性粒细胞计数比较 见表2。与正常对照组比较，模型组大鼠中耳黏膜中性粒细胞计数显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，利水通窍汤低、中、高剂量组和头孢克洛组大鼠中耳黏膜中性粒细胞计数显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。利水通窍汤各剂量组与头孢克洛组比较无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠中耳黏膜中性粒细胞计数比较(±s)

表2 各组大鼠中耳黏膜中性粒细胞计数比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常对照组模型组利水通窍汤低剂量组利水通窍汤中剂量组利水通窍汤高剂量组头孢克洛组n 6 8 6 7 8 7中性粒细胞计数(个/m2)2.00±0.63 14.37±1.59①13.17±1.47②12.14±1.57②10.63±1.51②10.57±2.37②

2.4 各组大鼠中耳黏膜中VEGF的表达比较 见表3。与正常对照组比较，模型组大鼠中耳黏膜中VEGF的表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，利水通窍汤低、中、高剂量组和头孢克洛组大鼠中耳黏膜中VEGF的表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。利水通窍汤各剂量组与头孢克洛组比较无统计学意义(P＞0.05)。

表3 各组大鼠中耳黏膜中VEGF的表达比较(±s)

表3 各组大鼠中耳黏膜中VEGF的表达比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常对照组模型组利水通窍汤低剂量组利水通窍汤中剂量组利水通窍汤高剂量组头孢克洛组n 6 8 6 7 8 7光密度值0.010±0.002 0.027±0.011①0.012±0.002②0.010±0.005②0.008±0.004②0.014±0.001②

3 讨论

目前研究表明参与ASOM发病过程的炎症介质有血管活性肠肽、P物质、组胺、花生四烯酸代谢产物等，这些炎症介质都有扩张血管、增加血管通透性的作用，进而造成中耳渗液的潴留[1]。VEGF可在体内诱导血管新生，是正常和异常血管新生的重要调节因子，在生理和病理性血管新生中起重要作用。VEGF受体特异性地分布于血管内皮细胞，VEGF通过与其特异性受体的结合，发挥生理功能：①促血管内皮细胞分裂从而促进新生血管形成；②增强血管通透性。李希平等[11]发现细菌内毒素能诱导大鼠ASOM；VEGF可能参与了ASOM急性期的中耳炎症反应。VEGF在急性中耳炎大鼠的中耳黏膜中表达上调，甚至在分泌性中耳炎患者的中耳渗液中VEGF检出率高达100%。因此本实验选用VEGF为指标，反应大鼠ASOM中耳黏膜的炎症改变。

急性分泌性中耳炎是耳鼻喉科临床上较常见的疾病之一，属于中医耳胀范畴，以起病急、耳内胀闷微痛、耳闭不聪、鼓膜混浊内陷等为特点。在治疗ASOM上，中医药因其副作用小有着明显优势。本研究应用临床常用方利水通窍汤，方中柴胡、石菖蒲、路路通以开耳窍之郁闭；黄芩、金银花清热解毒以利清窍；车前子、泽泻、茯苓利水渗湿，肺朝百脉，肺气不宣，多伴气血郁阻，而血不利则为水，故方中佐以行气活血之川芎、地龙等。诸药并用，共奏宣肺行水通窍之功效。本实验结果表明，正常对照组大鼠中耳黏膜VEGF的表达均较低，而在模型组中明显上调，符合其病理表现，即炎性细胞浸润及VEGF表达明显改变。利水通窍汤各剂量组的VEGF表达比模型组下调，病理切片上可见炎性细胞浸润较模型组减少，表明利水通窍汤可以抑制中耳黏膜中VEGF的表达，进而减轻由内毒素引发的中耳炎症。利水通窍汤治疗AOSM的机理可能是通过下调VEGF表达，减轻中耳黏膜水肿，降低炎性细胞在中耳黏膜中的浸润，来抑制中耳炎症。这一研究对阐明中药对AS0M的分子作用机制、创新中药新药研发和丰富现代中医理论具有重要意义。

本研究尚存在许多不足之处，主要有：①模型的问题：在实验过程中发现经鼓膜注射内毒素制作大鼠ASOM模型时易破裂，后改为经颈部正中切口，经听泡注射内毒素制备模型，模型可能存在颈部术口感染的可能。②检测指标偏少：本实验所选取的检测指标偏少，若能选取多些的检测指标，会更有说服力。

[1]付发祥，宋蕾．变态反应在分泌性中耳炎中的作用[J]．实用医院临床杂志，2011，8(5)：182-184.

[2]周桂英，邓湖山，陈世汉，等．分泌性中耳炎与变态反应的关系[J]．现代医药卫生，2007，23(8)：1173-1174．

[3]唐安洲，周永，李杰恩，等．分泌性中耳炎咽鼓管功能障碍的临床观察[J]．中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2001，7(4)：217-219．

[4]陈穗俊，梁象逢，郑亿庆，等．白介素-2在分泌性中耳炎中的临床意义[J]．中华耳科学杂志，2005，3(2)：93-95．

[5]谢明，周梁，金晓杰．白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-a在分泌性中耳炎渗出液中的表达及意义[J]．中华耳鼻咽喉科杂志，1998(6)：S37-39．

[6]段泽星，谢立群．VEGF在肿瘤生长和血管生成中的作用[J]．世界华人消化杂志，2010，18(27)：2894-2900．

[7]李京桂，林相国，许涛，等．VEGF家族及其在肿瘤生长中作用的研究[J]．现代生物医学进展，2012，12(4)：777-779．

[8]王文欢，伍仁毅，孙国瑛，等．VEGF-C和VEGF-D在胃癌组织中的表达与淋巴结转移的关系[J]．中南大学学报：医学版，2010，35(4)：335-340．

[9]李兰芳．宣肺利水通窍汤治疗急性分泌性中耳炎的疗效观察[J]．中外健康文摘，2011，45(8)：227-228．

[10]李希平，赵守琴，戴海江，等．肿瘤坏死因子-a在分泌性中耳炎动物模型中的表达[J]．中国耳鼻咽喉头颈外科，2005，12(4)：247-249．

[11]李希平，戴海江，赵守琴，等．血管内皮生长因子在实验性分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜的表达[J]．听力学及言语疾病杂志，2013，21(4)：387-390．