浮萍分布与水环境因子的相关性研究

陈 蕾， 成家杨， 谢 靖， 唐 杰

(北京大学深圳研究生院，广东深圳 518055)

浮萍(Lemnaminor)是最小的和最简单的水生植物之一，广泛分布于世界各地，多生长于湖泊、河流湾汊、沼泽、农田等静水之中。经过几十年的调查研究，目前已知的浮萍共分为5属38种，分别为青萍属(Lemna)、多根紫萍属(Spirodela)、少根紫萍属(Landoltia)、芜萍属(Wolffia)和无根芜萍属(Wolffiella)[1]。而中国的浮萍则以青萍、多根紫萍、少根紫萍和芜萍为主，共4属12种[2]。浮萍因其繁殖速度快、淀粉含量高、生物质产量大等优点，而成为极具潜力的新一代生物能源原料。Landolt等的研究结果表明，在适宜的生长条件下，浮萍的淀粉含量最高可达75%[3]；而Xu等的研究发现，浮萍的生物质干质量产量可达39.1～105.9 t/hm2，远高于玉米、柳枝稷、芒草等能源植物[4]。

浮萍除了作为生物能源的原料外，在污水处理领域也有广泛的应用，这主要归因于浮萍对各种水环境的较强适应力，以及其去除污水中的氮、磷和重金属的能力。如Xu等研究发现，紫萍能够很好地去除猪场稀释废水中的氨氮和磷酸磷，去除率分别为1.08、0.10 g/(m2·d)[5]；Miretzky等模拟自然环境的水污染，研究浮萍对重金属Fe、Zn、Mn、Cu、Cr和Pb的去除效果，结果表明，浮萍对这6种重金属的去除率分别可达78.47%、97.56%、95.20%、90.41%、96.64%和98.55%[6]；Dirilgen研究了不同Cr浓度条件下，青萍对Cr吸附效果的差异，结果表明，在pH值为5.0的条件下，当Cr处理浓度取 10 mg/L 时，青萍单位鲜质量去除量达最高，可达(863±38.8) mg/kg[7]。

浮萍虽具有潜在的污水处理能力，但不同种属浮萍甚至不同来源的同种浮萍在污染水体中的生长状况以及污水净化效果存在明显差异[8-13]。例如，Kanoun-Boule等研究发现，青萍对Cu的富集效果优于紫萍[10]；Chaudhuri等研究了不同浓度下青萍和紫萍对水体中Cd的去除能力，去除率分别为42%～78%和52%～75%[14]；紫萍对Cd的去除效果优于青萍，单位鲜质量去除量最高可达7 711.00 mg/kg；周雄飞研究发现，不同种属浮萍对总氮、总磷的去除效果不同，当青萍和紫萍以 1 ∶2 的比例混合培养时，对总氮、总磷的去除效果最好[15]。由此可见，浮萍对污水的耐受能力及处理效果与浮萍种属以及污水类型有直接关系。而自然界中的浮萍种属分布是否与其生活的水环境因子相关仍然不清楚，而相关研究结果对未来利用浮萍修复自然水体具有一定的指导意义。

本研究以江苏、广东2省的浮萍材料及其生活水环境为研究对象，调查区域性的浮萍分布及其生长水环境，并研究浮萍分布与水环境因子的相关性。本研究选择江苏、广东2地进行取样主要基于以下2个原因：(1)江苏、广东分别位于长三角、珠三角地区，都是工农业发达的省份，淡水资源污染呈上升趋势[16-17]。而对该地区浮萍的分布及其生长的水环境调查开展较少，限制了该地区浮萍资源的开发以及在水体净化方面中的应用。(2)两省地理位置相隔较远。较单一地区样品以及多地区样品更具有一般性，有助于保证相关性研究的准确性。

1 材料与方法

1.1 浮萍和水样采集

2015年4月，在江苏、广东2省随机选择了59个采样点进行样品采集，样品采集地的GPS信息和浮萍分布如表1所示。

表1 样品采集地浮萍分布及采集地经纬度

注：La、Lp、Sp、Wg分别代表青萍、多根紫萍、少根紫萍和芜萍；La+Sp代表青萍和多根紫萍共生；Sp+Wg代表多根紫萍和芜萍共生。

浮萍样品采集后，立即装入7.5 cm×10 cm的无菌密封袋中，并放置在简易冰盒中保存。同时，取40～50 mL的表层水样于50 mL离心管中，立即放入冰盒中保存。样品带回实验室后立即进行预处理。水样放入-20 ℃冰箱保存，而浮萍则按以下方法进行处理：首先用蒸馏水清洗浮萍，去除杂质；然后用0.5% NaClO溶液对浮萍叶片消毒1 min，再用去离子水漂洗2～3次，放入SH改良培养液中培养。SH改良培养液成分：硝酸钾2.50 g/L，硫酸镁0.20 g/L，磷酸二氢铵 0.30 g/L，无水氯化钙0.15 g/L，乙二胺四乙酸二钠 19.80 mg/L，六水氯化钴0.10 mg/L，无水硫酸铜0.20 mg/L，硼酸5.00 mg/L，碘化钾1.00 mg/L，一水硫酸锰10.00 mg/L，二水钼酸钠0.10 mg/L，七水硫酸锌1.00 mg/L。设置光照培养箱的温度为25 ℃，光照度为7 000 lx，光—暗周期为16 h—8 h，使其尽快适应实验室环境，快速增殖扩大生物量，用于浮萍分子鉴定。

1.2 浮萍种属鉴定

采用DNA Barcoding鉴定浮萍种属。使用植物基因组DNA提取试剂盒(深圳新拓扑生物科技有限公司)提取浮萍的总DNA，并合成用于扩增atpF-atpH间隔序列的引物(Forward：5′-ACTCGCACACACTCCCTTTCC-3′；Reverse：5′-GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT-3′)[18]。以浮萍总DNA为模板，采用PCR扩增atpF-atpH间隔序列。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，49 ℃退火 1 min，72 ℃延伸40 s，共进行35循环；最后72 ℃延伸 10 min。PCR产物经纯化后送到华大基因(BGI)进行测序。采用Lasergene.v7.1软件对测序结果进行分析和拼接，将组装序列在NCBI网站上(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Blast比对。根据Blast比对结果，选取参考浮萍序列。在MEGA 6.0软件中采用Neighbor-joining法绘制系统发育树，分析本研究收集浮萍与参考浮萍间的亲缘关系。

1.3 水样分析

1.3.1 水体pH值、氨氮、硝氮、总磷含量的测定 水样在测定之前，先用0.45 μm的滤膜过滤除杂，而后分别测定水体pH值(雷磁PHS-25)、氨氮含量(纳氏试剂分光光度法HJ535-2009)、硝氮含量(紫外双波长分光光度法)、总磷含量(过硫酸钾氧化-钼酸铵分光光度法GB 11893—1989)。

1.3.2 水体重金属浓度的测定 水样过0.22 μm的滤膜后，稀释10倍，采用Thermo Fisher X SERIESⅡ测量样品中重金属的浓度。首先，配制成0、20、25、50、100 μg/L系列标准溶液。以比率与浓度进行线性回归，绘制标准曲线。Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb这7种元素的标准曲线线性相关性较好，相关系数均大于0.999 0。然后，根据标准曲线的结果，计算水体中Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb这7种重金属的浓度。

1.4 浮萍种质资源分布与水环境影响因子相关性分析

采用CANOCO 4.53软件对实验数据进行除趋势对应分析(DCA)和RDA分析。首先进行DCA分析。DCA是一种间接排序方法，能够将分析对象在二维和三维空间加以梯度排列，一般来说，梯度长度小于3，选择线性模型比较合理，介于3～4之间，单峰模型和线性模型都是合适的，梯度大于4，选择单峰模型比较合理。对实验数据进行DCA分析后，梯度长度为1.456 4(<3)，因此使用线性模型RDA分析浮萍种属与环境因子之间的相关关系。在RDA排序图内，环境因子一般用箭头表示，箭头连线的长度代表某个环境因子与种属分布间相关程度的大小，连线越长，说明相关性越大。为消除量纲的影响，分析前用Excel 2010软件对数据进行lg(x+1)处理。

1.5 数据统计与分析

所有试验均设3个平行。利用Excel 2010和SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 浮萍种属鉴定

本研究总共获得了59份浮萍样品，其中4个样品存在2种浮萍共生现象(表1)，故共获得63株浮萍。经系统发育学鉴定(图1)，63株浮萍分别属于青萍(51株)、多根紫萍(9株)、少根紫萍(2株)和芜萍(1株)。结合表1可以看出，2个省的样品采集地浮萍分布均以青萍为主，其次是多根紫萍和少根紫萍。该结果与Tang等的研究[19]一致，表明在中国青萍的分布占主导优势，这可能跟其适应性相关。而本研究中鉴定的浮萍，除了JS10、JS20与参考浮萍L.aequinoctialis6612的相似度为97.7%和99.7%外，其余61株浮萍与其对应参考浮萍的相似度均为100%。结果表明这些浮萍的atpF-atpH基因序列相对保守，适合用于系统发育分析，能准确鉴定出浮萍的种属。

2.2 浮萍生长环境

分别从平均值、标准差、范围、中位数和变异系数对水样结果进行分析，评价浮萍生长水体的水质状况。因样品中少根紫萍和芜萍的数量较少，因此只列出了测定结果，而没有进行其他统计学分析。

2.2.1 浮萍生长水体的水质状况(pH值、氨氮、硝氮、总磷) 从表2中浮萍生长的pH值范围和中位数可以看出，青萍、多根紫萍均适宜在偏碱性的水体中生长，而少根紫萍和芜萍也采自碱性水体。青萍在6.70～9.50的酸碱环境中均有分布，相对于多根紫萍能够适应更广范围的pH值。张飞等对太湖流域的水体调查结果表明，青萍在pH值6.34～8.78的范围均有分布[20]，该研究中青萍具有更广的酸适应性，而本研究中的青萍具有更广的碱适应性。这些研究结果表明，青萍对水体pH值的耐受范围优于其他种属。因此，青萍可优先考虑用作治理pH值变化较大的水体。

根据我国GB 3838—2002《地表水环境质量标准》相关规定，V类水的氨氮浓度≤2.0 mg/L，总磷浓度≤0.4 mg/L。而本次采集的59份水样中，有25份水样的氨氮浓度、38份水样的总磷浓度超过了V类水标准。总体来看，本次采样地区的水体存在一定的氮、磷污染，部分水体污染较为严重。

本研究中青萍生长水体的氨氮浓度平均值远远高于其他3个种属，且青萍在氨氮浓度0～5.02 mg/L的范围均有分布，说明青萍对氨氮的耐受能力强，且适宜在氨氮浓度较高的水体中生长。因此，后续可进一步研究、筛选青萍品种治理氨氮污染水体。通过对比青萍和多根紫萍的水体环境发现，青萍生长水体的硝氮浓度范围是多根紫萍的2.5倍，平均值略低于多根紫萍。而张飞等的研究中，青萍与多根紫萍在水体硝氮浓度方面的差异并不显著[20]。这表明，不同来源的同种浮萍对硝氮的耐受能力存在差异，因此对地理小种生理特性的鉴定是非常必要的。此外，本研究中青萍所生长水体总磷的平均值为1.35 mg/L，为多根紫萍的1.5倍，且总磷浓度最高的采样点亦为青萍生长的水体，说明青萍对总磷的耐受能力更高，在0.04～9.05 mg/L范围均有分布。

表2 浮萍生长水体的pH值、氨氮、硝氮、总磷的含量

综上所述，青萍对pH值、氨氮、硝氮、总磷的耐受能力均强于多根紫萍，对水体各指标广泛的耐受能力可能是青萍广泛分布的主要原因。

2.2.2 浮萍生长水体的水质状况(重金属) GB 3828—2002《地表水环境质量标准》中规定Ⅱ类水体中Cr(六价)的浓度≤50 μg/L，Mn的浓度≤4 000 μg/L，Cu的浓度 ≤1 000 μg/L，Zn的浓度≤1 000 μg/L。从Cr、Mn、Cu、Zn这4个重金属浓度的指标来看，本次采集的水体样品均未超地表水Ⅱ类水水质标准(表3)。根据标准中对Ⅰ类水的规定，本次采集的59份水样均满足Ⅰ类水对Cd、Pb浓度的要求。总体来看，本次采集的水样受重金属污染程度较小。

对比表3中浮萍生长水体中的重金属含量发现，青萍生长水体的Mn浓度平均值为458.92 μg/L，Ni浓度平均值为11.92 μg/L，Cu浓度平均值为1.70 μg/L，Zn浓度平均值为30.19 μg/L，分别为多根紫萍的4.8倍、7.4倍、3.6倍、5.8倍，也高于少根紫萍和芜萍。这些结果表明，本研究中的青萍与其他浮萍品种相比，对Mn、Ni、Cu、Zn具有更广的重金属耐受范围。多根紫萍生长水体的Cr浓度平均值为10.00 μg/L，高于青萍的6.12 μg/L，亦高于少根紫萍和芜萍。多根紫萍生活水体的Cr浓度范围为5.37～28.93 μg/L，而青萍的仅为0.20～13.96 μg/L。虽然多根紫萍对Mn、Ni、Cu、Zn的耐受能力不如青萍，但是多根紫萍对Cr的耐受能力明显强于青萍，故在处理Cr含量较高的污染水体时，应优先考虑选用多根紫萍。因水样的Cd、Pb浓度均很低，故较难判断4个种属对Cd、Pb耐受能力的高低。

表3 浮萍生长水体的重金属浓度

浮萍对重金属的耐受能力因种属不同而存在差异。因此，广泛收集各地浮萍样本并筛选优质的浮萍品种，对有针对性地处理不同重金属污染的水体至关重要[21-22]。而自然界中的浮萍分布是否与水体重金属浓度有关，需要进一步的研究。

2.4 浮萍分布与环境因子相关性分析

本次采集的63株浮萍中，少根紫萍和芜萍仅有3株，分析其与环境因子的相关性不具代表性，故只对青萍和多根紫萍进行浮萍分布与环境因子的相关性分析。

2.4.1 利用Spearman分析环境因子自相关性 在进行浮萍与环境因子的相关性分析之前，首先对环境因子的自相关性进行分析。Spearman相关性分析能够评估环境因子两两之间的相关性，S-W检验结果显示，峰度系数和偏度系数均不为0，表明环境因子数据不符合正态分布，故采用Spearman进行相关性分析更为合理，分析结果如图2所示。从图2可以看出，Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 5个环境因子彼此之间显著相关(P<0.01)。为减少数据分析的重复性，从Cd、Ni、Pb、Zn、Cu中选择任意一种做后续分析即可，pH值、硝氮、氨氮、总磷、Cr、Mn皆可作为自由的环境因子。

2.4.2 利用RDA分析浮萍分布与环境因子的相关性 选择Cu作为Cd、Ni、Pb、Zn、Cu 5种环境因子的代表，pH值、硝氮、氨氮、总磷、Cr、Mn作为自由的环境因子，分析这7种环境因子与青萍、紫萍2个浮萍品种的相关性，RDA结果如图3所示。

RDA相关性分析结果显示，环境因子对青萍和多根紫萍分布的影响从高到低依次为氨氮、pH值、Cr、总磷、硝氮、Mn、Cu。RDA的总解释量为27.57%，第一坐标轴、第二坐标轴轴线分别解释了26.45%、1.12%的浮萍分布与环境因子的相关性。经过对所有约束特征值999次1%的置换迭代计算(表4)，得出浮萍分布与环境因子的相关显著性P值，结果表明，pH值、氨氮的P值均小于0.05，表明这2个环境因子与青萍和多根紫萍的分布具有显著相关性，其中氨氮对浮萍的分布具有极显著影响(P<0.01)。

表4 浮萍分布与环境因子相关显著性检验

注：“**”表示极显著相关(P<0.001)；“*”表示显著相关(P<0.01)。

RDA分析结果显示氨氮对浮萍分布的影响最大，表明浮萍生长对氨氮浓度很敏感。一方面，氨氮能够提供浮萍生长所需要的营养元素N，另一方面，氨氮浓度过高会抑制浮萍的生长。Ingermarsson等的研究结果也表明，浮萍的细胞膜能够对NH4+做出响应[23]，具体机制目前还尚未清楚。Warren研究发现，当水体中氨氮浓度过高时，电离出的NH3会扰乱浮萍代谢[24]。本次调查过程中发现，江苏水样氨氮的平均值为0.810 mg/L，远低于广东地区的平均值2.710 mg/L。广东地区水体的氨氮浓度过高，因此耐受能力较差的多根紫萍、少根紫萍、芜萍难以存活，只有青萍可以适应生长。这或许是江苏地区浮萍多样性更丰富的原因之一。RDA的分析结果还表明，pH值对浮萍分布具有显著影响。许多研究也表明，pH值对浮萍的生长、发育以及重金属的修复等方面具有显著影响[25]。本次调查，广东地区和江苏地区水体pH值平均值分别为7.801和7.753，pH值范围分别为7.160～9.500和 6.700～9.220。江苏地区水体pH值稍低于广东地区，这或许也是江苏地区浮萍覆盖广、品种多的另一个原因。

3 结论

从江苏、广东2地采集的浮萍经鉴定为青萍、多根紫萍、少根紫萍和芜萍。其中青萍占所采集样品数的81%，为优势浮萍品种；水质分析表明，采样地区的水体存在一定的氮、磷污染，部分水体较为严重。青萍、多根紫萍均适宜在偏碱性的水体中生长。而青萍能够适应更广范围的pH值，对氨氮、硝氮、总磷的耐受能力也比其他浮萍强，是青萍广泛分布的原因之一；所采集59份水样的重金属浓度均未超地表水Ⅱ类水质标准，受重金属污染程度较小。青萍与其他浮萍品种相比，对Mn、Ni、Cu、Zn具有更广的耐受范围，而多根紫萍对Cr的耐受能力较好；氨氮、pH值与浮萍分布具有显著相关性，是导致2个地区浮萍差异分布的主要因素。

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