四跨膜蛋白超家族Tetraspanins在肿瘤及纤维化疾病中的作用概况

李春艳 高胜兰 刘 刚

1 Tetraspanins

1.1 Tetraspanins的结构

Tetraspanins即四跨膜蛋白超家族，它是一类在所有多细胞真核生物中表达的小分子跨膜蛋白，分子量多在20～30 kDa。该家族共有39个成员，其中有34 种在哺乳动物中被发现，在人类已经确认33种，包括Tspan1～Tspan33。四跨膜蛋白结构上由4 个疏水性跨膜结构域及其在细胞外形成的两个大小不等的环状结构EC1、EC2和在细胞内形成的短氨基端、羧基端组成[1](如图1)。Tetraspanins的大细胞外环即EC2结构域由两个亚结构域组成，一个是具有极大变异性的亚结构域，其氨基酸的序列和蛋白质的折叠受关键的二硫键支配；另一个是高度保守的亚结构域，其保守基序包括4个不变的半胱氨酸残基：CCG(Cys-Cys-Gly)，PXSC(Phe-X-Ser-Cys)和EGC(Glu-Gly-Cys)[2-3]。四跨膜蛋白的EC2环是四跨膜蛋白和其他跨膜蛋白如整联蛋白或其他信号分子之间相互作用所必需的[4]。四跨膜蛋白的功能主要取决于该蛋白质的序列、翻译后修饰及组织细胞分布。四跨膜蛋白具有2种重要的翻译后修饰功能，包括EC2环上的N-糖基化和跨膜区CXXC基序的棕榈酰化。大部分的四跨膜蛋白在大的EC2环中具有一个或多个N-糖基化位点，但有2个除外，即在小EC1环中具有N-糖基化位点的CD9和非糖基化的CD81[5]。目前为止，所发现的四跨膜蛋白均含有棕榈酰基结构，棕榈酰化与蛋白质的形态及其在质膜中的功能密切相关。多数情况下，半胱氨酸残基翻译后的酰化或棕榈酰化对四跨膜蛋白富集区域(TEMs)的组成至关重要，相反，四跨膜蛋白棕榈酰化的缺失，会影响它与其他信号分子的相互作用，亚细胞分布，生物合成过程中的稳定性以及细胞形态[6]。四跨膜蛋白超家族的成员在基因水平也有一定的关联性，具有20%～30%的氨基酸序列同源性。

图1 Tetraspanin结构模式图[7]

四跨膜蛋白EC2的可变结构域由两个二硫键(橙线)稳定，保守基序由4个不变的Cys残基(黄色)组成，其中2个Cys残基位于Cys-Cys-Gly(CCG)基序(黄色和绿色)中。

1.2 Tetraspanin Enriched Microdomains(TEMs)

尽管Tetraspanins的作用和机制尚未被完全了解，但已明确其在真核细胞的质膜中起到支架蛋白的作用。四跨膜蛋白可以与自身或其他四跨膜蛋白以及与众多配体蛋白质结合，形成“四跨膜蛋白网络”或“四跨膜蛋白富集区域”(TEMs)，从而作为质膜的结构和功能单位发挥作用[1]。TEMs可以作为信号平台，类似于脂筏，但通常由不同的组分组成。另外，Tetraspanins通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用以及TEMs的特异性组成，而对各种蛋白质包括整合素，免疫球蛋白超家族蛋白，蛋白酶，生长因子受体和细胞内信号分子的功能起到修饰作用[2]。四跨膜蛋白的4个跨膜区域对TEMs的组成及生物功能至关重要，参与了分子内部和分子之间的相互作用。尽管四跨膜蛋白的EC2环存在高度保守的半胱氨酸基序，它亦是四跨膜蛋白结构中最可变的区域，是四跨膜蛋白与其他蛋白相互作用所必需的，且在特异性分子的识别及功能中起重要作用。四跨膜蛋白不仅参与各种正常的细胞过程如细胞信号转导、细胞粘附、迁移、增殖、分化等，还参与各种病理过程包括血管生成、肿瘤转移、炎症和病毒感染[1]。

关于四跨膜蛋白是否参与信号转导的过程，有研究者认为，尽管四跨膜蛋白与其他跨膜蛋白有许多关联，但能够与胞质蛋白质相互作用的四跨膜蛋白非常少，因为四跨膜蛋白在胞质内的部分即氨基端和羧基端很短，通常小于20个氨基酸[8]，这使得四跨膜蛋白不直接参与信号转导。但有研究报导了一些四跨膜蛋白能够与细胞内的信号蛋白相关联，比如细胞质伴侣PI4K、PKC和其它信号蛋白等[9]，因此，四跨膜蛋白能通过与受体蛋白结合及相互作用而影响细胞信号传导。

基于四跨膜蛋白的结构特征，其突出于细胞外的部分至多5 nm，大部分四跨膜蛋白被认为不可作为潜在的细胞表面受体[10]。近来越来越多的研究对这一观点提出了质疑。据报道，CD9具有多种可溶性的配体，其可替代肥大细胞中IL-16受体，诱导巨噬细胞释放IL-10，IL-6和TGFβ；还能结合PSG17(妊娠期间释放的一种胎盘蛋白)，对卵、精子的融合起到重要作用，而CD9缺陷的雌性小鼠表现出生育障碍[11-12]。CD81已被确定为丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的基本受体，且CD81上E2的结合位点位于紧邻EC2环二硫键的内螺旋中[13]。CD82作为内皮细胞表面蛋白DARC的受体，它的表达能够抑制肿瘤转移，而这种抑制作用在DARC敲除小鼠中被消除[14]。尽管有这些偶然的报道，四跨膜蛋白以反式作用的方式结合内源性配体的能力目前仍有争议。

1.3 Tetraspanins的组织分布

几乎在所有的组织和细胞类型中都能发现四跨膜蛋白，它们在细胞膜表面和/或细胞内囊泡表达，而且每个成员表现出不同的表达谱[7]。例如，四跨膜蛋白CD9、CD63、TSPAN7、CD81、CD82和CD151在各种细胞类型中广泛分布，而C37(B细胞)和CD53(淋巴和骨髓细胞)主要存在于造血细胞中[5, 15]。仅有几种四跨膜蛋白(UP1 a，UP1b，外周蛋白和ROM-1)的分布限于特定的组织[16]。尽管四跨膜蛋白在多种细胞类型中表达丰富，但缺乏某些四跨膜蛋白的动物并未显示出异常的表型，可能由于其他四跨膜蛋白对其功能的补偿作用。而有些单个Tetraspanin基因的突变或缺失可造成危及生命的疾病，在某些情况下，我们观察到缺乏特定四跨膜蛋白的小鼠，与具有相同四跨膜蛋白缺陷的人类相比，表现出相似的疾病表型[1]。如CD151敲除的小鼠能自发形成衰老相关的肺纤维化，CD37缺失的小鼠能自发形成淋巴瘤等；在这些致死性疾病的人群中同样发现有相同蛋白的表达缺陷[17-18]。因此，不同的四跨膜蛋白对疾病有着不同的影响。

2 Tetraspanins与疾病

2.1 Tetraspanins与肿瘤

2.1.1 Tetraspanins与肿瘤转移 细胞癌变的过程涉及多种机制，包括基因突变、基因过度表达或表达不足、内分泌激活和表观遗传改变。这些变化的积累导致细胞基因表达的平衡丧失，从而造成细胞发生转化[19]，进而获得肿瘤细胞特性。Tetraspanins超家族成员参与调节细胞增殖、运动、粘附、血管生成及肿瘤转移[20]。有研究发现CD82 / KAI1与前列腺癌的进展呈负相关，CD9在癌症进展期间表达下调，提示该四跨膜蛋白具有肿瘤抑制作用[21-22]。自从Testa等[23]人首次发现CD151在促进肿瘤迁移及转移中的作用以来，众多研究已经在各种肿瘤中寻找到这种四跨膜蛋白的异常表达。CD151影响非小细胞肺癌、胰腺癌及结直肠癌中的细胞运动和侵袭，并且也在中性粒细胞、成纤维细胞和内皮细胞的迁移中起作用[24-26]。已经证实CD151表达与前列腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、食管鳞状细胞癌、肝内胆管癌、乳腺癌和肝细胞癌的预后和存活时间相关[24, 27-32]。同样地，TSPAN1和TSPAN8在胰腺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤中表达上调，提示其对肿瘤发展的促进作用[33]。以上研究表明，四跨膜蛋白Tetraspanins与肿瘤转移具有相关性。

2.1.2 整合素、EMT与肿瘤转移 人体内的单层上皮细胞通过细胞与细胞之间紧密连接蛋白如E-钙黏蛋白以及细胞表面蛋白整合素与基底膜蛋白的结合而维持上皮细胞的形态。当上皮细胞发生转化及癌变时，整合素在肿瘤细胞的侵袭和转移起到重要作用。整合素与细胞外的配体结合形成复杂的蛋白结构，使ECM与应力纤维结合，形成细胞质肌动蛋白细胞骨架，并在蛋白酪氨酸激酶的控制下，影响细胞的粘附及运动[34]。近年来，越来越多的证据表明整合素参与了肿瘤血管生成、淋巴管生成及癌症的转移。在内皮细胞中，已发现整合素参与诱导血管生成[35-36]。整合素α1β1、α2β1、α4β1、α5β1、α9β1、α6β4、αvβ3和αvβ5在血管生成中起作用，而整合素α2β1、α4β1、α5β1和α9β1参与淋巴管生成[37-38]。在血管生成的过程中，与纤连蛋白和玻连蛋白结合的整合素α5β1、αvβ5和αvβ3表达上调，而与基础ECM成分胶原蛋白和层粘连蛋白结合的整合素如α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β4等则趋于下调[39]。血管内皮生长因子作为血管(VEGF-A)和淋巴管(VEGF-C和VEGF-D)生成的主要调节因子，整合素α9β1与VEGF-A，-C和-D直接相关[40-43]。因此，整合素的表达变化是调控细胞内信号转导途径及参与肿瘤转移的重要决定因素。

上皮间质转化(EMT)作为一种上皮细胞向间充质细胞特异性转化的过程,在上皮性癌的侵袭和转移中起着重要作用。研究影响EMT的相关因素，能够帮助我们更好地了解癌性上皮细胞如何从相邻细胞分离，侵入相邻组织，并获得转移的能力。已有研究表明，整合素作为一类极为重要的粘附分子，与钙黏蛋白一同参与了EMT 的发生。整合素不仅在细胞与细胞间及细胞与细胞外基质间的黏附功能中起关键作用,还通过激活多种激酶的酪氨酸磷酸化级联反应,介导多种信号转导通路,直接或间接的参与EMT过程[44]。因此，EMT与肿瘤转移相关，而整合素与EMT存在一定的相互作用。

2.1.3 Tetraspanins与整合素 研究发现，Tetraspanins能与其他细胞膜分子如整合素结合，调控细胞形态、细胞迁移和免疫反应等[45]。整合素对细胞粘附、细胞迁移、细胞周期和凋亡起着重要作用。它们不具有任何内在活性，仅存于细胞表面，通过与各种ECM蛋白和微环境信号相互作用，形成整合素依赖性信号传导途径，调节细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和血管生成[46]。与层粘连蛋白(层粘连蛋白是基底膜中的细胞粘附蛋白)结合的整合素主要是α3β1、α6β1、α6β4和α7β1[47]。四跨膜蛋白超家族成员如CD81、CD9、CD53、CD63、CD82和CD151与整合素关系密切，它们与整合素一起在各种类型的人类细胞中参与调节细胞形状，细胞迁移及信号转导[48]。有证据表明CD81与α4β1整合素相关，而CD151与α3β1、α6β1、α6β4和α7β1相关[49-50]。Berditchevski等[34]学者研究显示，四跨膜蛋白CD81和CD151能够直接与整合素相互作用，并由此将其他蛋白分子与整合素整合到一起。例如，磷脂依赖性丝氨酸和苏氨酸激酶的PKC家族作为细胞内蛋白质，其与几种不同的四跨膜蛋白例如CD9、CD81、CD82和CD151结合，并特异性存在于四跨膜蛋白的胞内结构域中，于是四跨膜蛋白充当连接分子而将PKC与β1、β2和β3整联蛋白相结合[51]。有研究显示，CD151-α3β1复合物的形成是大多数研究的重点，其在细胞内信号转导中起到重要作用，尤其是肌动蛋白-细胞骨架动力学的变化导致细胞迁移侵袭的形成[48]。CD151作为整合素依赖性细胞运动信号转导过程中的基本连接子，对细胞内整合素的定位起到重要作用，从而影响癌症的侵袭和转移[52-53]。因此，Tetraspanin影响其与整合素结合，并影响细胞整合素的分布和转运，从而影响细胞运动性和侵袭性。

2.1.4 Tetraspanins与EMT EMT与肿瘤转移相关，有研究显示，四跨膜蛋白参与调节EMT过程。例如，已发现四跨膜蛋白超家族成员CD151能够与β1整合素形成复合物，增加β1整合素与其配体的亲合力，影响皮肤黑色素细胞的迁移能力。另有研究显示CD151能够下调E-钙黏蛋白的表达促进肝癌细胞的侵袭与转移。Lupia等[54]的研究证实了CD63在黑色素瘤细胞EMT过程中起到负性调控作用。通过RNAi技术沉默CD63后，黑色素瘤细胞的运动能力及基质降解能力均增加，同时伴有E-钙黏蛋白的下调及N-钙黏蛋白和Snail蛋白的上调；而过表达CD63后，细胞的运动及侵袭性明显降低，同时伴有N-钙粘蛋白，波形蛋白，Zeb1和a-SMA的减少；将过表达CD63的黑色素瘤细胞移植到裸鼠皮下，观察到肿瘤发生率及肿瘤生长速率明显降低。以上均表明了四跨膜蛋白通过影响肿瘤EMT过程而促进肿瘤进程。

2.2 Tetraspanin与纤维化疾病

2.2.1 EMT与纤维化 大量研究证实，纤维化是一种与肿瘤的发病机制存在很多相似之处的疾病，其最大的共同特点即是EMT[55]。纤维化疾病如特发性肺纤维化等的研究一直是研究的热点及难点，其发病机制至今仍不清楚。过去观点认为，炎症反应在纤维化疾病的发展过程中扮演重要角色，但随着研究的深入，越来越多的证据表明，上皮驱动的异常可能是其发病机制的关键。众多研究显示，异常活化的支气管或肺泡上皮细胞分泌的生长因子、趋化因子等对成纤维细胞的活化、增殖及迁移起到重要作用。这些上皮细胞通过EMT而发生表型转换，是成纤维细胞/肌成纤维细胞的重要来源。

2.2.2 CD151与肺纤维化 Tsujino研究团队证明了上皮细胞的完整性在纤维化疾病的发病过程中起到关键作用[17]。他们发现四跨膜蛋白CD151作为一个通过对基底膜的粘附作用而维持上皮完整性的基本分子，它的缺失能够促进上皮细胞间质性改变及TGF-β信号通路的活化，最终导致自发性的肺纤维化的发生。他们进一步研究发现，CD151敲除的小鼠肺组织中，与结缔组织相关的基因表达异常升高，而在这些异常升高的基因中，多数与细胞外基质相关，如Collagen-1 和Collagen-3，表明CD151的缺失能够造成肺的纤维化改变。另外，形态学、功能学和生物化学证据显示CD151敲除小鼠在30周龄时出现明显的纤维化，但无明显的炎症反应。并且，CD151敲除的小鼠表现出低剂量博来霉素气管灌注就能加速上皮完整性的丧失，导致严重的纤维化及死亡率的增加。同时，这一纤维化的过程在肝内胆管及肾小球也能观察到。从CD151敲除的小鼠肺组织中分离的肺泡上皮细胞，其上皮完整性丧失，表现出形态细长，α-平滑肌肌动蛋白表达增加，P-Smad2的表达上调并与α-平滑肌肌动蛋白和前表面活性蛋白C染色的共定位，这些证据均表明肺泡上皮细胞发生了EMT。有研究观察到，正常人的肺组织中大多数肺泡上皮细胞(AECs)表达CD151，但在IPF病人的肺组织中CD151阳性的肺泡上皮细胞数量明显减少，表明这种四跨膜蛋白的下调可能在IPF的发病机制中起重要作用。

2.2.3 TM4SF5与肝纤维化 TM4SF5因其具有4个跨膜结构域，最初被认为是四跨膜蛋白超家族Tetraspanins的成员之一，之后的研究认为其在EC2环中缺乏相应的保守区域如CCG基序，而与TM4SF1(L6,L6-Ag)、TM4SF4(IL-TIMP)、TM4SF18(L6D)、TM4SF19和TM4SF20组成四次跨膜L6家族成员[56-57]。TM4SF5与肝癌EMT相关，而超过80%的肝癌病例与晚期纤维化或肝硬化有关联，Kang等的研究证实了TM4SF5参与肝纤维化的发生[57-58]。TM4SF5在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中表达上调，同时伴有纤维化隔膜区域中α-平滑肌肌动蛋白表达升高、EMT标志物的表达改变及I型胶原蛋白的沉积，且与TGFβ1介导的Smad通路以及EGFR信号通路相关。在动物模型中使用抗TM4SF5试剂TSAHC，间质标志物明显下调，纤维化程度减轻。(TSAHC最初被筛选为α-糖苷酶抑制剂，其影响TM4SF5细胞外环2即EC2环的结构完整性及N-糖基化(Asn-138/Asn155),从而影响TM4SF5的功能。)Kang等[59]进一步研究证实了TM4SF5与CD151、CD63之间在肝细胞纤维化及肝细胞迁移、侵袭中的关系。其研究表明TM4SF5与CD151在肝细胞纤维化及迁移侵袭过程中具有协同作用，并且TM4SF5在CD151的上游；而TM4SF5 和CD151均能够拮抗CD63在肝纤维化发展过程中以及肝细胞迁移/侵袭过程中的作用。目前，四跨膜蛋白与纤维化疾病相关的研究并不多，相信随着研究的不断深入，将会有更多的四跨膜蛋白在纤维化疾病中的作用会被挖掘出来。

3 小结

本文主要论述了Tetraspanins的基本结构和功能以及其在肿瘤、纤维化疾病中的作用。EMT作为肿瘤与纤维化疾病共有的特点，在疾病的发病过程中扮演着重要的角色。Tetraspanins如CD151、CD63等通过影响肿瘤EMT过程从而促进肿瘤进程，CD151、TM4SF5等参与纤维化疾病的EMT发病过程。关于Tetraspanins与整合素的相互作用，在肿瘤疾病的研究中报道较多，而在肺及肝纤维化中尚未被报道。Tetraspanins影响疾病的具体机制还需更多更深入的研究。Tetraspanins作为细胞表面分子，在细胞信号通路中起着关键的桥梁作用，是一个潜在的治疗靶标，随着今后对Tetraspanins的深入研究，将为疾病的预防和/或治疗提供更有价值的实验依据。

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