芦丁与奥司他韦联合对H1N1流感病毒神经氨酸酶的抑制作用

王心佳,于 淼,李源博,王 烨,于大海,毛春玲，全吉淑*,房学迅*

(1.延边大学医学院 生物化学与分子生物学,吉林 延吉133002；2.吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室,吉林 长春130023;3.吉林亚泰(集团)有限公司药物研究与开发中心,吉林 长春130000；4.长春职业技术学院)

流行性感冒是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传染病。流感在传播过程中具有致病性强、潜伏期短、致死率高等特点,这些特点都对人类的健康构成巨大的威胁[1]。流感病毒是一种单股负链的RNA病毒,属于正黏病毒科,流感病毒属[2]。在流感病毒的表面分布着两种糖蛋白,分别是：HA(血凝素)和NA(神经氨酸酶)。其中,NA在流感病毒对宿主细胞的侵染过程和子代病毒的释放过程都起着关键的作用[3-6]。其原理为：流感病毒表面的HA可与宿主细胞表面的唾液酸受体以糖苷键的方式结合在一起,NA的作用表现为可切断二者的连接,由此,流感病毒可脱离宿主细胞从而重新侵染其它宿主细胞进行复制,达到流感病毒继续传播的作用。所以,以NA为靶点的抗流感病毒药物已经成为全球学者研究的重点。

中药在我国有几千年的历史,我国在治疗流感方面积累了大量的理论和实践经验。研究发现：连翘、金银花、炙甘草、穿心莲等数十种中药对流感病毒都有一定的抑制作用[7]。研究表明,许多从中药中分离出的中药单体对NA具有抑制作用,包括挥发油类、芪类、生物碱类、黄酮类、多糖类和萜类化合物。其中黄酮类化合物对神经氨酸酶普遍具有抑制作用[7]。芦丁是植物界分布较广的一种黄酮类化合物,临床上主要用于脆性增加的毛细血管出血症。王艳芳等[8]研究表明芦丁对流感病毒感染导致的小鼠肺部病变具有保护作用。丁玥等[9]研究结果表明,芦丁仅在流感病毒感染后给药后表现出抗流感病毒活性,说明芦丁可能作用于流感病毒的释放和扩散阶段。

目前,对流感进行治疗的药物主要是奥司他韦。但在治疗过程中发现,许多类型的流感病毒对奥司他韦都具有一定的抗药性[10]。有临床实验表明早期适当隔离措施和中西医结合救治,大多数患者可以康复,中西医结合治疗疗效快,效果好,并且可以降低耐药性的出现[11]。李效全等运用利巴韦林联合双黄连口服液抗病毒治疗轻型甲型H1N1流感取得了良好的效果[12]。也有研究发现,两种或多种NA抑制剂类药物与奥司他韦联合使用可以明显降低流感病毒对奥司他韦的抗药性,并可以增加在同等剂量下奥司他韦对NA的抑制率[13,14]。

本文主要研究了中药单体NA抑制剂芦丁与奥司他韦联合使用对H1N1型流感病毒神经氨酸酶NA(N1)活性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

公司仪器美国Bio-TekFLX800荧光酶标仪芬兰Finnpipette雷勃微量移液器上海信谊微量振荡器日本SANYO超低温冰箱

1.2 实验试剂与材料

芦丁(20 mg)单体化合物购买自上海源叶生物科技有限公司,将购买的芦丁标准品用 DMSO稀释至浓度为20 mM,存放于1.5 ml离心管并置于4℃冰箱内保存。

NA底物MU-NANA(Cas:M8639)和MES均购买自Sigma公司。

达菲(奥司他韦)购买自大连博格林生物科技有限公司。

重组甲型流感病毒 H1N1 神经氨酸酶 (A/New Caledonia/20/1999 (H1N1))购买于北京义翘神州公司。

1.3 常用溶液配制方法

MES缓冲溶液：用100 ml去离子水将CaCl20.044 g,MES 0.64 g溶解,并调节pH值至6.5,即可配制出32.5 mM含有4 mM CaCl2的缓冲溶液,将其放置在4℃冰箱中留存备用。

1.4 实验方法

1.4.1芦丁与奥司他韦对H1N1流感病毒神经氨酸酶IC50的测定

首先我们加入体积分别为40 μl的N1和10 μl的芦丁,使芦丁在其混合液中的终浓度分别为0 μM,50 μM,100 μM,150 μM,200 μM。在37℃下孵育30 min,然后加入体积浓度各为50 μl 20 μM NA的特异性底物MU-NANA,使反应终体积为100 μl,每个芦丁浓度重复4次。最后在酶标仪上检测荧光强度,激发波长为360 nm,发射波长为450 nm,检测8 min。取4次测定荧光强度平均值,绘制成横坐标为抑制剂浓度,纵坐标为平均反应速率的拟合曲线,我们根据拟合曲线的拟合方程计算出抑制剂对H1N1流感病毒神经氨酸酶IC50值。(IC50值：当酶活性抑制百分数等于50时,此时抑制剂的浓度为此抑制剂对此种酶的IC50)。相同原理,我们加入体积为1 μl其分别为 0 nM,0.5 nM,0.75 nM,1 nM,1.25 nM,1.5 nM,1.75 nM,2 nM浓度的奥司他韦,同样方法计算出IC50。

1.4.2芦丁对H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制类型的测定

本实验研究中使用双倒数作图方式测定芦丁对N1抑制类型。我们在酶标板中的每孔加入10 μl浓度为0.02U N1以及40 μl分别为0,50,100,150,200 μM浓度的芦丁,轻微震荡后在37℃下孵育30 min,每个浓度重复4次。接着每孔加入50 μl神经氨酸酶特异性底物,即MU-NANA,其底物浓度分别为0.5,1,1.5,2 nmol。最后使用酶标仪测定其各自的荧光值,激发波长360 nm,发射波长450 nm,共计测定8 min,记录结果并取平均值。根据结果使用双倒数作图方式,即横坐标为芦丁浓度倒数,纵坐标为荧光强度的倒数,以此进行分析芦丁对N1的抑制类型。

1.4.3芦丁与奥司他韦联合对H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制效果测定

为了测定芦丁与奥司他韦联合使用对N1的抑制活性,我们测定了芦丁与奥司他韦的联合指数CI(combination index)(CI值可以将两种或多种药物混合后的效果进行定量的分析)。CI的计算公式如下公式：

实验中我们添加体积为10 μl分别为 0.5倍,1倍,2倍,4倍IC50浓度的芦丁与之对应同倍数IC50浓度的奥司他韦联合,一并与体积为30 μl H1N1流感病毒神经氨酸酶混合,然后在37℃下孵育30 min,最后每孔加入50 μl 神经氨酸酶特异性底物MU-NANA(反应终体系为100 μl)检测N1的荧光强度。实验重复4次,取平均值。

表1 CI值与化合物相互作用的评判标准

2 结果

2.1 芦丁与奥司他韦对H1N1流感病毒神经氨酸酶的抑制活性

我们配制分别为50,100,150和200 μM浓度的芦丁与0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2 nM浓度的奥司他韦,根据结果分别计算其对N1抑制活性(IC50),见表2。

表2 芦丁和奥司他韦对H1N1流感病毒神经氨酸酶抑制的IC50值

2.2 芦丁对H1N1流感病毒神经氨酸的抑制类型

为了探究芦丁对N1的抑制类型,我们分别用不同浓度的芦丁,即0,50,100,150,200 μM芦丁与N1作用,再分别用不同浓度底物,即浓度分别为0.5,1,1.5,2 nmol的MU-NANA,以此测定N1的反应速率,得到相对应的荧光值。通过不同的芦丁浓度与反应速率的双倒数曲线判断芦丁对N1的抑制类型。如图1所示,横坐标为抑制剂芦丁浓度倒数,纵坐标为反应速率倒数,曲线相交于X轴负轴上,此结果说明芦丁对N1是非竞争抑制,即抑制剂芦丁结合在N1的非催化位点区域。

图1 芦丁对N1抑制类型的测定

2.3 芦丁与奥司他韦在体外联合使用对H1N1流感病毒神经氨酸酶的作用

为检测芦丁与奥司他韦联合使用对NA的抑制活性,我们测定了不同浓度下的芦丁与奥司他韦的联合指数。根据芦丁与奥司他韦对N1 IC50,确定芦丁与奥司他韦的联合浓度分别为各自0.25,0.5,1,2和4倍的IC50浓度。如图2(A)所示,X轴表示奥司他韦浓度,Y轴表示联合用药对N1的抑制速率,两条曲线分别表示芦丁与奥司他韦联合曲线和奥司他韦单独作用于N1的曲线,可以得出,芦丁与奥司他韦联合使用抑制率强于单独使用奥司他韦对N1抑制率；如图2(B)X轴表示芦丁浓度,Y轴表示奥司他韦浓度,通过图中曲线我们得出芦丁与奥司他韦联合对N1是协同抑制的作用效果。联合指数CI值如表3所示,在测试浓度下均小于1,同样表示出芦丁与奥司他韦联合使用对H1N1流感病毒神经氨酸酶是协同的抑制作用效果。

图2 芦丁和奥司他韦联合使用对NA的抑制活性

表3 芦丁和奥司他韦联合使用对N1的CI

3 讨论

神经氨酸酶是流感病毒的一种重要膜蛋白,在流感病毒对宿主的早期侵染定位和子代病毒的释放过程中都起着关键的作用。因此,对于NA抑制剂的研究成为研究抗流感药物的热点[15]。

达菲是目前为止治疗流感病毒最有效的药物,但是随着其广泛的使用,抗药性流感病毒已经出现的越来越频繁。在H1N1中的H275Y是奥司他韦的抵抗型病毒,对奥司他韦的敏感性有了些许程度的降低[16]。并且达菲的使用过程中发现,对儿童的治疗可能导致其死亡[17]。而在实际治疗过程中发现,一些复方药物或者联合使用的药物,可以明显增强药物的治疗效果,或者降低达菲的使用量减少达菲对人体的损伤。葛资宇等[18]研究发现麻杏石甘汤与奥司他韦联合用药对A型流感病毒感染小鼠有保护作用,能抑制流感病毒感染所致的体重下降,降低肺指数,减轻肺组织病理损伤,效果优于麻杏石甘汤组,联合用药组能提高脾指数、胸腺指数,效果优于奥司他韦组。李健猴等[19]研究表明黄芩苷与帕拉米韦联合抗流感作用比单独使用效果好,在临床上具有重要的应用价值。

本课题组的研究验证了芦丁是对N1具有抑制活性的单体。本课题组通过生物信息学的方式,利用计算机分子模拟对接方法发现：配体结构芦丁还可成功对接在受体H1N1流感病毒神经氨酸酶生物大分子的非活性区域,类属非竞争性抑制作用。酶学实验与生物信息学方式都验证了芦丁对N1是非竞争性抑制作用。奥司他韦对N1是竞争性抑制作用[20]。二者分别结合在N1的不同位点,从而为芦丁与奥司他韦联合对N1抑制作用的探究奠定了基础。

我们对芦丁与奥司他韦进行了联合指数的测定,以此来确定两种药物的联合使用能否促进奥司他韦对N1抑制活性。首先找出N1的最适浓度,即N1浓度与活性成线性关系时其N1的最大浓度。我们测得其最适浓度为0.02U。随后,我们又测定了芦丁和奥司他韦对N1的IC50。然后,我们根据测定的芦丁与奥司他韦对N1的IC50,确定了联合使用时芦丁与奥司他韦的浓度。最后,我们根据联合使用对N1抑制的结果计算CI值,发现芦丁与奥司他韦联合使用表现出对N1协同抑制的作用效果。

芦丁类属维生素类药,可使毛细血管通透性和脆性减弱,同时可保持及恢复毛细血管的正常弹性。在防治高血压脑溢血,糖尿病视网膜出血和出血性紫癜等用途中较高,也用作食品抗氧剂和色素。可在芸香叶、烟叶、枣、杏、橙皮、番茄、荞麦花等植物中发现芦丁。我们的研究表明,芦丁在抗流感方面具有一定的应用价值。

药物的联合使用不仅仅是能够降低对于患病者的使用量,而且在对于对某种特异性抑制的药物来说,与不同药物的联合使用也能使其达到很好的治疗效果。本研究为我们以后在临床中治疗流感提供了实验的依据。

作者简介：王心佳,女,硕士在读,研究方向：天然分子生物活性研究;全吉淑,女,博士生导师、教授,研究方向：天然分子生物活性研究;房学迅,男,博士生导师、教授,研究方向：基质金属蛋白酶的生物功能、酶抑制剂的发现与生物活性。

参考文献：

[1]Taubenberger J K,Morens D M.The pathology of influenza virus infections[J].Annual Review of Pathology,2008,3(3):499.

[2]Nicholson K G,Wood J M,Zambon M.Influenza[J].Lancet,2003,362(9397):1733.

[3]Wang X,Jia W,Zhao A,et al.Anti-influenza agents from plants and traditional Chinese medicine[J].Phytotherapy Research Ptr,2006,20(5):335.

[4]Russell R J,Haire L F,Stevens D J,et al.The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggests new opportunities for drug design[J].China Prescription Drug,2006,443(7107):45.

[5]Betakova T.M2 protein-a proton channel of influenza A virus[J].Current Pharmaceutical Design,2007,13(31):3231.

[6]Das K,Aramini J M,Ma L C,et al.Structures of influenza A proteins and insights into antiviral drug targets[J].Nature Structural & Molecular Biology,2010,17(5):530.

[7]卢芳国.中药对流感病毒神经氨酸酶活性影响的实验研究与思考[C].世界中医药学会联合会中医药抗病毒研究专业委员会学术年会.2015.

[8]王艳芳,王新华,朱宇同,等.芦丁对甲型流感病毒抑制作用实验研究[J].中华中医药学刊,2005,23(5):827.

[9]丁 玥,曹泽彧,柯志鹏,等.芦丁对流感病毒的体外抑制作用及其机制研究[J].现代药物与临床,2015,30(12):1431.

[10]Al S P E.Chinese-like Strain of Porcine Epidemic Diarrhea Virus,Thailand-Volume 15,Number 7-July 2009-Emerging Infectious Disease journal-CDC[J].Emerging Infectious Diseases,2009,15(7):1112.

[11]张秀芹,吴宇欣,王志国,等.中西医结合治疗流行性感冒[J].长春中医药大学学报,2017,33(2):272.

[12]李效全,刘佳易,胡 琪.利巴韦林双黄连口服液治疗轻型甲型H1N1流感的临床观察[C].2010全国中西医结合危重病、急救医学学术会议.2010:47.

[13]Yu M,Wang Y,Tian L,et al.Safflomin A inhibit neuraminidase activity and influenza virus replication[J].Rsc Advances,2015,5(114):94053.

[14]Wang Y,Yu M,Wang X,et al.Jatrorrhizine hydrochloride potentiates the neuraminidase inhibitory effect of oseltamivir towards H7N9 influenza[J].Rsc Advances,2015,5(80):64937.

[15]于 杨.宿主hnRNPC2在A型流感病毒感染过程中的作用机制研究[D].浙江大学,2016.

[16]Van D V E,Anber J,Van D L A,et al.Molecular assays for quantitative and qualitative detection of influenza virus and oseltamivir resistance mutations[J].Journal of Molecular Diagnostics Jmd,2013,15(3):347.

[17]Moscona A.Oseltamivir-resistant influenza?[J].Lancet,2004,364(9436):733.

[18]葛资宇,童 骄,那婧婧,等.不同煎煮方法的麻杏石甘汤及其含药血清对A型流感病毒神经氨酸酶活性的影响[J].中国中西医结合杂志,2016,36(9):1119.

[19]李健猴,凌芳芳,杜金燕,等.黄芩苷联合帕拉米韦体内外抗甲型H1N1流感病毒作用[J].中国药理学通报,2013,29(5):617.

[20]Taylor,Garry L.Influenza Virus Neuraminidase Inhibitors[B].Handbook of Cell Signaling,2003:105.