山梨酸纳米微粒在冷却猪肉保鲜中的应用

王佳奕，王 綪，丁 武*

冷却肉以营养丰富、鲜嫩多汁等特点深受消费者欢迎，是我国的主要肉类消费产品[1]。冷却肉又称冷鲜肉，是指对严格执行检疫制度屠宰后的畜禽胴体迅速进行冷却处理，使胴体温度（以后腿为测量点）在24 h内降至0～4 ℃，并在后续的加工、流通和零售过程中始终保持在0～4 ℃范围内的预冷加工肉制品[2]。但0～4 ℃贮藏条件下冷却肉的货架期较短，这主要是由猪肉中的蛋白质、脂质、水分等引起微生物生长繁殖和脂质氧化导致的[3]。多项研究表明，利用涂膜保鲜技术可以抑制腐败菌的生长繁殖以及脂肪氧化，实现延长冷却肉货架期的目的[4-7]。

壳聚糖（β-（1,4）-2-氨基-脱氧-D-吡喃葡萄糖）是甲壳素脱乙酰基的产物，具有良好的生物相容性、成膜性以及抗菌性[8]。由于分子间的氢键作用，壳聚糖在生理溶液中溶解性较差，限制了其在食品工业中的应用。壳聚糖纳米颗粒作为活性物质载体受到广泛关注，Mao Haiquan[9]和Qi Lifeng[10]等在研究中将壳聚糖纳米粒应用于基因载体和药物递送系统。壳聚糖纳米粒常用壳聚糖与三聚磷酸盐通过离子凝胶化法进行制备[11]。基于纳米颗粒的量子尺寸效应，与壳聚糖相比，壳聚糖纳米颗粒具有更强的抗微生物活性[10]。

山梨酸是国际卫生组织推荐使用的一种安全高效的保鲜剂，可以参与人体新陈代谢，对霉菌和酵母的生长有良好抑制作用[12]；但山梨酸水溶性较差，限制了它的使用范围。本研究采用离子凝胶法制备山梨酸纳米微粒，改善山梨酸分散性，扩大山梨酸的使用范围，利用纳米粒的缓释性能使山梨酸更好地发挥抑菌作用。目前，国内外鲜见山梨酸纳米微粒在冷却肉保鲜中的研究。

本研究采用前期优化工艺制备山梨酸纳米微粒[13]对冷却猪肉进行涂膜处理，分别用空白纳米微粒、山梨酸钾以及未经处理的冷却猪肉作为对照，通过测定各处理组的菌落总数、霉菌和酵母总数、总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值、pH值和肉样红度等指标，考察山梨酸纳米微粒的抑菌及抗氧化效果，旨在为延长冷却肉的货架期提供理论依据和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖（脱乙酰度≥95%）、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，TPP）、山梨酸（均为分析纯） 上海阿拉丁试剂有限公司；营养琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、生物试剂 北京奥博星生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；85-2恒温测速磁力搅拌器 金坛荣华仪器制造公司；UV-2500紫外分光光度计 日本岛津公司；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；WSC-S测色色差计 上海精密科学仪器有限公司；WGP-400智能恒温恒湿培养箱箱 宁波海曙赛福试验仪器厂；PHS-3C酸度计 上海日岛科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山梨酸纳米微粒的制备

山梨酸纳米微粒及空白纳米微粒的制备参照武陶等[13]的方法，采用离子凝胶化法进行。

精确称取适量壳聚糖，室温下于10 g/L冰醋酸溶液中溶解，将溶液pH值调至5，用0.45 μm微孔滤膜过滤后在室温下搅拌过夜，获得1 mg/mL的壳聚糖溶液。精确称取1.5 g TPP，溶于1 L超纯水，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，获得1.5 mg/mL TPP水溶液。精确称取0.5 g山梨酸粉末，溶于1 L乙醇，获得0.5 mg/mL山梨酸溶液。

将12 mL 0.5 mg/mL山梨酸溶液逐滴（2～3 滴/秒）加入30 mL 1 mg/mL壳聚糖溶液中，室温下搅拌30 min，再逐滴（2～3 滴/秒）加入4 mL 1.5 mg/mL TPP溶液，室温下搅拌40 min，其中搅拌速率为600 r/min，最终溶液中壳聚糖、TPP、山梨酸的物质的量之比为5∶1∶1，溶液中的壳聚糖和TPP经阴阳离子静电作用交联包埋山梨酸形成山梨酸纳米微粒。获得的山梨酸纳米微粒粒径为335.4 nm，包埋率为70%。

据了解，目前全国各大医院都会举行庄严而隆重的药师宣誓仪式,这些充满正能量的宣誓仪式，让药师感受到这个职业的神圣，深切体会到肩负的责任与担当。例如，北京大学第三医院药剂科，每一位新药师在正式上岗之前，都有一次郑重的宣誓仪式。宣誓仪式是激励年轻药师的一项举措，让年轻的药师认识到自己所从事职业的重要性，从而以严肃认真的态度来面对药学工作，发挥更大的作用[13]。

将4 mL 1.5 mg/mL TPP溶液逐滴（2～3 滴/秒）加入30 mL 1 mg/mL壳聚糖溶液中，室温下搅拌40 min，搅拌速率为600 r/min，壳聚糖与TPP的物质的量之比为5∶1，溶液经阴阳离子静电作用交联形成空白纳米微粒，作为对照。

山梨酸钾溶液：其质量浓度与山梨酸纳米微粒中包埋的山梨酸质量浓度相同。

1.3.2 肉样处理

将购买的新鲜猪肉置于4 ℃冰箱24 h进行冷却排酸处理后，在超净工作台中分割成200 g左右的肉块。随机分为4 组，每组3 块，一组作为空白对照组，不作任何处理。另外3 组分别用山梨酸纳米微粒、空白纳米微粒、山梨酸钾溶液进行浸渍处理，每组样品浸渍8 min，取出沥干10 min，用聚氯乙烯保鲜膜包装，置于4 ℃冰箱冷藏。

以处理当天为计时起点第0天，分别在贮藏的15 d内的第1、4、7、10、13、15天定期对冷却猪肉的各项指标进行测定。

1.3.3 指标测定

菌落总数采用GB/T 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[14]中规定的方法测定。根据GB/T 9959.2—2008《分割鲜、冻猪瘦肉》[15]将评价标准分为三级：一级鲜度菌落总数小于1×104CFU/g，二级鲜度在1×104～1×106CFU/g之间，变质肉大于1×106CFU/g。

霉菌和酵母总数采用GB 4789.15—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母总数测定》[16]中规定的方法测定。

TVB-N含量采用GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[17]中的半微量定氮法测定。根据GB/T 9959.2—2008进行评价，要求TVB-N含量小于15 mg/100 g[15]。

TBARS值的测定方法在Nam等[18]的方法上加以改进，采用双波长600 nm和532 nm比色测定的方法。

pH值的测定按照GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》[19]中的方法进行。根据评价标准（pH 5.8～6.2为新鲜肉，pH 6.3～6.6为次鲜肉，pH值大于6.7为变质肉）对肉质进行判断。

红度利用WSC-S全自动测色色差计进行测定。在空白对照组及各处理组肉样上随机取点测定，并计算平均值。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2007软件进行数据录入，利用DPS 7.05软件进行数据处理，采用Duncan法进行显著性分析（P＜0.05），使用SigmaPlot 10.0进行制图。

2 结果与分析

2.1 冷却猪肉在贮藏过程中菌落总数的变化

图1 冷却猪肉在贮藏过程中菌落总数的变化Fig. 1 Changes in total bacterial counts of chilled pork during storage

从图1可知，山梨酸纳米微粒组和空白纳米微粒组样品的菌落总数在贮藏初期呈现下降趋势，之后随贮藏时间延长而增加，说明山梨酸纳米微粒和空白纳米微粒涂膜处理能够降低冷却猪肉初始菌落总数。空白对照组和山梨酸钾组的菌落总数呈现持续增长趋势。在整个贮藏期间，空白对照组的菌落总数显著高于其余各处理组（P＜0.05），在第7天菌落总数为6.46（lg（CFU/g）），超过腐败水平6.0（lg（CFU/g））[15]；各处理组在第10天菌落总数均低于6.0（lg（CFU/g））；其中山梨酸纳米微粒处理组的菌落总数在贮藏12 d后超过腐败水平6.0（lg（CFU/g）），与空白对照组相比货架期延长了5 d。在贮藏期内，山梨酸纳米微粒组的菌落总数显著低于空白对照组（P＜0.05）；贮藏时间超过7 d时，山梨酸纳米微粒组的菌落总数显著低于其他处理组（P＜0.05），表明山梨酸纳米微粒可以有效抑制冷却猪肉中微生物的增殖，在贮藏中后期山梨酸纳米微粒发挥了缓释性能。

2.2 冷却猪肉在贮藏过程中霉菌和酵母总数的变化

本研究选择第0、5、10、15、20天进行霉菌和酵母总数的测定，具体结果如图2所示。各处理组的霉菌和酵母总数在贮藏初期呈现下降趋势，之后随贮藏时间延长而不断增加，表明各处理组保鲜剂具有降低霉菌和酵母初始菌落数的作用。空白对照组的霉菌和酵母总数在贮藏期间持续上升，显著高于其余处理组（P＜0.05）。山梨酸纳米微粒组的霉菌和酵母总数显著低于空白处理组与空白纳米微粒组（P＜0.05），表明以纳米粒形式存在的山梨酸可有效抑制霉菌和酵母的生长；但与山梨酸钾组差异不显著（P＞0.05），表明山梨酸及其盐类均能有效抑制霉菌和酵母的生长[12]。

图2 冷却猪肉在贮藏过程中霉菌和酵母总数的变化Fig. 2 Changes in the total number of molds and yeasts in chilled pork during storage

2.3 冷却猪肉在贮藏过程中TVB-N含量的变化

图3 冷却猪肉贮藏过程中TVB-N含量变化Fig. 3 Changes in TVB-N content of chilled pork during storage

TVB-N是肉品被侵染或肉本身含有的微生物引起蛋白质脱氨、脱羧等作用所产生的碱性物质，是评价肉类产品新鲜度的重要指标。如图3所示，空白对照组及各处理组TVB-N含量随贮藏时间延长均呈上升趋势。空白对照组TVB-N含量在第7天已达到16.80 mg/100 g，超过GB/T 9959.2—2008限定值15.00 mg/100 g[15]，表明冷却猪肉已发生腐败变质。通过空白纳米微粒涂膜处理的冷却猪肉的TVB-N含量在第10天达到15.73 mg/100 g。而由山梨酸纳米微粒涂膜处理的冷却肉保鲜效果最好，第13天超过限定值，与空白对照组相比货架期延长了6 d，TVB-N含量较其他处理组上升缓慢。表明山梨酸纳米微粒作为冷却肉涂膜保鲜剂能有效抑制微生物的作用，减缓蛋白质分解。

2.4 冷却猪肉在贮藏过程中TBARS值的变化

TBARS值是反映脂肪氧化后期终产物含量的一个指标，通过测定氧化终产物丙二醛的含量评价肉品脂肪氧化程度[20]。由图4所示，在冷却猪肉贮藏期间，空白对照及各处理组样品均发生脂肪氧化，TBARS值整体呈上升趋势。其中山梨酸纳米微粒组冷却猪肉的TBARS值在贮藏过程中出现下降，可能是由于样品中的丙二醛作为氧化的中间产物被氧化为有机酸，使丙二醛无法继续与TBARS反应导致[21]。空白对照组的TBARS值上升最快，其在贮藏过程中均显著高于其他处理组（P＜0.05），表明空白对照组冷却肉样品脂肪氧化程度显著高于其他处理组（P＜0.05）。山梨酸纳米微粒组TBARS值相比于其他处理组较小并且上升较缓慢，贮藏15 d后达到0.73 mg/kg，显著低于空白对照组（P＜0.05），表明山梨酸纳米微粒具有抑制脂肪氧化的作用。

图4 冷却猪肉贮藏过程中TBARS值的变化Fig. 4 Changes in TBARS value of chilled pork during storage

2.5 冷却猪肉在贮藏过程中红度的变化

图5 冷却猪肉贮藏过程中a值的变化Fig. 5 Changes in a value of chilled pork during storage

肉样红度用a值表示。a值为正时表示偏红，a值越大肉色越红，说明肉类被氧化的程度越小。如图5所示，各实验组冷却猪肉样品的a值在整个贮藏期间总体呈下降趋势。与空白对照组相比，贮藏7 d后，各处理组的a值显著高于空白对照组（P＜0.05），表明各处理组保鲜剂对红度都具有保护性。山梨酸纳米微粒对红度有良好的保护效果，在贮藏7 d后，其a值显著高于空白纳米微粒组及山梨酸钾组（P＜0.05），表明山梨酸纳米微粒具有良好的抗氧化性能。

2.6 冷却猪肉在贮藏过程中pH值的变化

如图6所示，各处理组及空白对照组的pH值在整个贮藏过程中呈上升趋势，这是肉类中的蛋白质在微生物分泌的酶的作用下发生脱羧、脱氨反应而生成碱性含氮物质引起的[22]。空白对照组pH值上升较快，在第10天达到6.6，猪肉表面发黏，出现腐败变质现象。与空白对照组相比，各处理组样品pH值上升缓慢。山梨酸钾组的pH值始终高于其他处理组，这可能是呈碱性的山梨酸钾溶液处理样品后导致pH值上升。而山梨酸纳米微粒组的pH值在整个贮藏期内均低于6.8，与空白对照组相比货架期延长了5 d，显著低于空白对照组（P＜0.05），表明山梨酸纳米微粒作为冷却肉保鲜剂可以对微生物繁殖起到有效抑制作用，延缓pH值上升。

图6 冷却猪肉贮藏过程中pH值的变化Fig. 6 Changes in pH of chilled pork during storage

3 讨 论

壳聚糖具有良好的成膜性，其作为天然防腐剂应用于肉品保鲜中已成为国内外研究的热点[23-25]。壳聚糖对一系列食源性微生物具有体外抗菌活性[26]，在肉制品贮藏期间能够有效抑制微生物的生长[26-27]。壳聚糖的抗氧化性能使其在肉制品贮藏期间能够有效延缓脂肪氧化[26-28]。山梨酸对霉菌、酵母具有良好的抑制作用[29]。通过壳聚糖和TPP的阴阳离子静电作用交联包埋山梨酸制备的山梨酸纳米微粒，具有抑菌、抗氧化性能，以及纳米微粒的缓释作用[13]，可以获得更好的保鲜效果。

微生物是导致冷却肉在贮藏过程中腐败的主要原因，肉品表面营养丰富、水分充足，适宜微生物生长繁殖[30]。肉品中含有的大量易被氧化的不饱和脂类化合物也会导致冷却肉在贮藏过程中变质。本研究发现山梨酸纳米微粒可以减缓TBARS值的上升，山梨酸钠纳米微粒组的TBARS值显著低于空白对照组（P＜0.05），表明山梨酸纳米微粒能够有效抑制脂肪氧化；山梨酸钠纳米微粒组a值显著低于空白对照组（P＜0.05），表明山梨酸纳米微粒对肉样红度具有保护作用。冷却猪肉经优化工艺制备的山梨酸纳米微粒涂膜处理后，其菌落总数、霉菌和酵母总数、pH值显著低于空白对照组（P＜0.05），TVB-N含量在贮藏后期显著低于空白对照组（P＜0.05），表明山梨酸纳米微粒对微生物生长起到有效的抑制作用。综合上述指标测定结果可知，经过山

梨酸纳米微粒涂膜处理，冷却猪肉的货架期延长了5 d，达到了保持肉样新鲜度、延长货架期的目的。

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