n-HA/PA66复合材料植入在兔脊柱结核模型中的应用效果

范华华，孙厚杰，韩建华，蔡小军

(遵义市第一人民医院·遵义医学院第三附属医院，贵州遵义563000)

脊柱结核致残率高，严重威胁人类健康，目前病灶清除植骨融合内固定术已成为脊柱结核外科治疗的经典术式[1]。相关植骨材料的研究发现也成为人们关注的热门课题，自体骨因供骨量不足，异体骨宿主反应甚至疾病传播，使其应用受到一定限制。目前常用钛网进行植骨支撑融合，但钛网植骨无法了解植骨融合情况,且钛网易移位及下降,导致融合失败、再发畸形等并发症。纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(n-HA/PA66)复合生物材料因其具有良好生物相容性、骨传导性、成骨活性及生物力学特性，已被应用于创伤脊柱外科[2～4]。然而由于脊柱结核属感染性病灶，结核分枝杆菌对n-HA/PA66复合材料是否能像钛网等金属材料一样产生惰性，是否会黏附材料表面或聚集在材料内，国内外文献暂未见相关报道。2015年1月～2017年3月,本研究通过建立兔脊柱结核动物模型，然后在病灶内植入n-HA/PA66复合材料人工椎体，观察植骨融合及结核治疗情况，为临床应用提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级健康新西兰白兔60只，由遵义医学院动物实验中心提供，雌雄不限，体质量2.0～3.0 kg，结核菌素试验阴性。饲养条件：动物房严格消毒，温度23 ℃，相对湿度70%，标准兔高压饲料饲养。人型结核分枝杆菌H37Rv标准菌株混悬液(1×107cfu/mL)购自新疆畜牧科学院兽医研究所，4 ℃冷藏保存。弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司。实验植骨材料：n-HA/PA66复合生物材料人工椎体购自四川国纳科技有限公司提供；钛网及内固定材料购自山东威高医疗器械有限公司。

1.2 模型制备 新西兰白兔背侧颈跟部皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL，其中3只于注射后3周腹泻死亡，剩余57只新西兰白兔于致敏后1个月颈部皮肤发现直径0.9～1.8 cm硬结，皮肤无破溃。取致敏的57只新西兰白兔，将其腰背部脱毛(直径约12 cm)，取左侧卧位，将其固定在兔专用板上。采用氯胺酮、安定、阿托品(比例:2 mL∶2 mL∶1 mL，用生理盐水稀释1倍)进行联合麻醉，经耳缘静脉缓慢注入(2.5 mL/kg)。麻醉后，沿右侧第12肋末向下至髂嵴作一纵行切口(长约6 cm)，将腰4、5椎体显露；于腰5椎体上部近椎间盘处，从右前方向左后方(与椎体远端呈30°)进入，钻骨孔(深约0.5 cm、孔径约0.25 cm)，止血后填入医用明胶海绵。然后用注射器缓慢将结核菌悬液(0.1 mL)注于明胶海绵上。最后用1-0丝线间断关闭切口、关闭深筋膜，于皮下涂洒30万U/只注射用青霉素粉剂，无菌纱布覆盖并固定。术后观察动物一般情况，包括动物进食、活动、精神状态、切口情况。如动物切口出现感染，立即淘汰。术后1～2个月内观察症状，术后2个月行X线片、CT、MRI检查，观察脓肿和死骨形成、病灶数目、病变范围、骨质破坏程度、脊髓受压、椎间盘异常情况，并进行解剖学及组织病理学变化观察以验证模型是否成功建立。57只新西兰白兔，造模术后20 d因进食不良死亡2只，造模后47 d，结核全身播散死亡2只，切口感染死亡1只，实际存活52只。成功率为86.67%(52/60)。

1.3 分组及处理 造模后2个月，随机选取36只造模成功新西兰兔分为两组，钛网植骨组和n-HA/PA66植骨组，每组18只。植骨融合内固定术：麻醉及显露同建模术，清理周围脓液，制备植骨床，取自体髂骨松质骨颗粒填充至钛网中,将植骨材料钛网及n-HA/PA66分别植入钛网植骨组和n-HA/PA66植骨组植骨床内，微型指钛钢板固定牢固，术后采用异烟肼5 μg/(kg·d)、利福平1.25 mg/(kg·d)抗结核治疗。

1.4 观察指标及其评价或检测方法 分别于术后1 d、1个月、2个月、3个月两组各取6只实验兔行X线检查，术后3个月采用Lane-Sandhu法[5]根据X线检查结果对骨形成、骨连接及骨塑型情况进行评分。骨形成情况：无骨形成为0分，骨形成占缺损15%～25%为1分，骨形成占缺损26%～50%为2分，骨形成占缺损51%～75%为3分，骨形成占缺损76%至充满缺损区为4分；骨连接情况：骨折线清晰为0分，骨折线部分存在为1分，骨折线消失为2分；骨塑型情况：未见塑型为0分，髓腔形成为2分，皮质骨塑型为4分。骨形成、骨连接及骨塑型三项评分相加取平均值。ESR、血清CRP：分别于术前、术后1、3个月经实验兔耳缘静脉采集静脉血1.5 mL，采用血沉检测仪检测ESR。离心机以3 000 r/min离心5 min,取血清。采用ELISA法检测血清CRP。结核分枝杆菌对植骨材料的黏附能力：术后1 d，两组各取6只实验兔，用异戊巴比妥钠麻醉后将其处死，原切口进入术区，将植入材料取出，用PBS溶液清洗3次，冲掉未黏附的细菌，置于3%戊二醛于4 ℃下固定过夜，用PBS溶液清洗3次，梯度乙醇脱水，零界点干燥过夜，表面喷金，用扫描电镜观察，随机选取10个视野(×5 000)计数黏附的结核分枝杆菌数目，取平均值。

2 结果

2.1 两组骨形成、骨连接及骨塑型情况 术后1 d兔子饮食差、活动少，手术切口无明显红肿、渗液。术后1个月，n-HA/PA66植骨组材料两端可见骨痂形成，且材料与自体骨界限不清；钛网植骨组未见明显骨痂形成，材料与自体骨间隙仍较清楚。术后2个月，n-HA/PA66植骨组材料周围大量骨痂形成，材料与自体骨界面模糊；钛网植骨组材料两端有骨痂形成，但明显较n-HA/PA66植骨组少；术后3个月两组材料均与自体骨结合，对位对线好，材料与自体骨界面模糊，有大量新生骨痂包裹材料，n-HA/PA66植骨组骨痂明显多于钛网植骨组。术后3个月，n-HA/PA66植骨组Lane-Sandhu评分为(6.92±2.05)分，钛网植骨组为(4.10±1.14)分，n-HA/PA66植骨组Lane-Sandhu评分高于钛网植骨组(P<0.05)。

2.2 两组手术前后ESR、血清CRP水平比较 术前两组ESR、血清CRP水平比较，P均>0.05;术后1、3个月两组ESR、血清CRP水平均较术前降低(P均<0.05)；术后1个月，n-HA/PA66植骨组ESR、血清CRP水平均低于钛网植骨组(P<0.05)；术后3个月两组ESR、血清CRP水平比较，P均>0.05。见表1。

2.3 结核分枝杆菌对植骨材料的黏附能力比较 n-HA/PA66植骨组光滑表面黏附的结核分枝杆菌数目为(3.47±1.15)个/视野，粗糙表面黏附的结核分枝杆菌数目为(15.04±6.40)个/视野；钛网植骨组光滑表面黏附的结核分枝杆菌数目为(30.20±7.15)个/视野，粗糙表面黏附的结核分枝杆菌数目为(49.32±10.24)个/视野。两组比较,P均<0.05。

表1 两组手术前后ESR、血清CRP水平比较

3 讨论

脊柱结核属特异感染性疾病，过去一直认为在感染病灶中植入内植物会导致结核分枝杆菌在其表面黏附聚集，且抗生素难以到达内植物表面，有使感染经久不愈甚至扩散的风险[5]。Oga等[6]从细菌黏附的角度研究表明，与金葡菌比较，结核分枝杆菌不易黏附金属异物表面。Ha等[7]研究也发现，结核分枝杆菌对钛合金异物的亲和力、黏附性较小，增殖力弱，产生小又薄生物膜，为结核病灶中植入内植物的安全可行性提供了理论依据。由于钛金属组织相容性好，取材方便，支撑固定可靠，克服自体骨取骨量大、异体骨易发生宿主反应，甚至引起疾病传播等缺点，钛网作为一种植骨支撑材料目前已被多数专家学者所接受并普遍应用于脊柱结核病灶清除后植骨融合环节。有研究[8,9]表明，应用钛网植骨2年以上，前柱高度有不同程度的丢失，一般术后丢失4°～6°；另外，X射线遮挡效应不利于观察椎体间融合情况，钛网价格昂贵。

n-HA/PA66复合生物材料中的羟基磷灰石作为骨修复替代材料具有良好的生物相容性[10],聚酰胺具有骨胶原类似的结构，生物相容性良好。将n-HA/PA66材料用于修复兔桡骨缺损，显示出该材料具有良好的成骨能力[11]。临床观察中，n-HA/PA66复合生物活性材料具有良好的生物相容性和安全性，未发现该材料的不良反应[12,13]。通过国内许多实验研究和临床观察已初步发现，n-HA/PA66复合材料作为良好的植骨填充材料，应用于修复非感染性骨缺损安全有效。然而该复合材料应用在感染性骨缺损中的动物实验和临床研究国内鲜见有报道。四川达州市人民医院报道临床应用该复合生物材料治疗脊柱结核“效果满意”[14]，我们认为该新生材料在没有大量动物实验研究结果支持下盲目应用于临床脊柱结核患者是一种冒险且有悖于伦理道德的行为；报道中“效果满意”缺乏评价标准，缺乏影像学资料证实及长期随访观察。

本课题拟对兔腰5椎体实施H37Rv结核菌悬液攻毒建模后，分别植入n-HA/PA66和钛网，比较两种植骨材料在脊柱结核中的应用效果。术后1～3个月两组植入的材料逐渐被新生骨痂包裹，且逐渐与自体骨融合，但n-HA/PA66植骨组术后1个月即有大量骨痂生成，且与自体骨融合。术后3个月，n-HA/PA66植骨组Lane-Sandhu评分高于钛网植骨组。提示与钛合金比较，n-HA/PA66复合材料能更快地促进骨痂生成及骨融合，说明HA/PA66复合材料的相容性更好。

ESR、CRP是临床监测早期感染、病情进展的重要指标，二者水平变化可反映炎症反应和组织损伤程度[15]。术后1、3个月两组ESR、血清CRP水平均较术前降低，术后1个月n-HA/PA66植骨组ESR、血清CRP水平较钛网植骨组低。说明n-HA/PA66材料能降低脊柱结核兔模型炎症指标水平，从而减轻实验动物的炎症状态。探讨细菌对生物材料的黏附能力，可为该材料临床应用的安全性进行评价。结核分枝杆菌对n-HA/PA66复合材料的黏附能力弱于钛网。本研究中n-HA/PA66植骨组光滑表面与粗糙表面黏附的结核分枝杆菌数均少于钛网植骨组，与文献报道一致。说明n-HA/PA66复合材料用于临床比较安全。

综上所述，n-HA/PA66复合材料植入可促进脊柱结核兔模型骨融合进展及骨痂生长，降低ESR、血清CRP水平，且材料表面黏附的结核分枝杆菌少，效果优于钛网植入。但本研究时间短，未对比钛网与n-HA/PA66复合材料植骨融合在治愈率、融合率、复发率及不良事件等方面的差异，后期研究中将对以上问题进行探讨。

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