小反刍动物慢病毒通用PCR检测方法的建立与初步评价

杨义琴 ，吴建勇 ，古努尔·吐尔逊 ，李建军 ，杨学云 ，贾 斌 ，王登峰 *

（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2.新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），新疆 乌鲁木齐 830000）

小反刍动物慢病毒 （Small Ruminant Lentiviruses，SRLV）是梅迪-维斯纳病毒 （Maedi visna virus，MVV）和山羊关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV）两种逆转录病毒的统称；基于病毒pol-gag基因序列的进化分析将其分为A、B、C、D和E五个亚群[1,2]。病毒感染后可通过前病毒DNA形式将遗传物质整合到宿主单核细胞和巨噬细胞中，使宿主持续感染，并通过初乳、常乳和呼吸道分泌物持续或间接性排毒而扩大感染[3,4]。两种病毒感染具有一定的宿主特异性，即CAEV多感染山羊，而MVV倾向于感染绵羊；然而近年来的分子流行病学调查发现，该病毒可跨种感染家养和野生山羊亚科和绵羊亚科动物，并在实验室也获得了交叉感染的相关证据[2,5,6]，因而建立通用的CAEV、MVV核酸检测方法极为必要。

目前，研究报道了聚合酶链式反应(PCR)、DNA印迹法、原位杂交或PCR克隆测序、RT-PCR等[7,8]等方法以检测、定量和鉴定MVV和CAE前病毒DNA，用于补充血清学试验无法确定的可疑感染[9,10]，但由于小反刍动物慢病毒具有多个不同亚群，已建立的PCR扩增方法仅能检测其中某一亚群病毒，多用于某个国家或地区特定的MVV和CAEV的检测[7,10]，并且课题组前期研究中证实了我国SRLVs主要为A2、B1亚群（未发表），因此亟待建立适用于我国SRLVs早期检测的技术方法。

本研究在比对分析已公开的CAEV和MVV基因组序列基础上，筛选vif基因中约150 bp序列作为诊断标识物，设计简并引物，建立PCR扩增方法，通过对实验室保存CAEV和MVV病毒RNA和前病毒DNA检测，初步证实该方法具有一定的可行性，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株

山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）参考株（ATCC VR-905）购自美国菌种保藏中心（ATCC），山东分离株（KT749878.1）、贵州株（Guizhou，KT749880.1）和梅迪-维斯纳病毒（MVV40）由本实验室保存。 CAEV 和MVV分别接种山羊关节滑膜细胞和绵羊的脉络丛细胞持续培养14 d，收取培养上清，4℃，8000×g离心10 min，提取上清RNA，反转录成cDNA作为待测模板；提取细胞培养物前病毒DNA作为待测模板。

1.2 试剂

中量血液基因组DNA提取试剂盒（0.5-3 mL）（DP332)、病毒RNA提取试剂盒(DP315-R)、2×Taq PCR Mastermix（KT201-02）、D2000 DNA Marker(MD114）、QuantScript RT Kit（KR103）均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物设计与合成

登陆GenBank获取所有CAEV和MVV的前病毒基因组（截止2017年5月30日），获取24株CAEV前 病 毒 基 因 组 M34092.1、M34093.1、EU293537.2、M33677.1、NC 001463.1、GU120138.1、AY900630.1、KT749881.1、KT214469.1、KT749879.1、KT749880.1、KT749878.1、KT898826.1、HM210570.1、GQ381130.1、FJ195346.1、JF502416.1、JF502417.1、AF322109.1、KY358787.1、KY358788.1、KT453990.1、KT453989.1 和KT453988.1；MVV 的 前 病 毒 基 因 组 7 个 ， 获 取 号 为 :HQ848062.1、NC001452.1、L06906.1、M10608.1、M51543.1、M60610.1和AF479638.1，使用ClustalX 2.1进行全基因组比对，筛选可设计引物的片段约200 bp，设计简并引物P1和P2；同时，根据Giovanni.B报道[8]合成扩增CAEV的引物CAEV-R-1和CAEV-F-1，引物序列见表1，所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 小反刍动物慢病毒扩增引物信息

1.4 靶序列的合成与制备

选择MVV前病毒基因组L06906.1和AF479638.1，CAEV前病毒基因组KT453988.1、KT749878.1和KY358787.15138-5233区序列作为模板序列，交由上海生工进行全基因合成，将合成的靶序列从质粒上经酶切、胶回收、核酸定量后作为测试模板。

1.5 PCR扩增与电泳

扩增反应采用25 μL反应体系:其中2×Taq Mastermix 12.5μL，引物终浓度P1为1.2 mM，P2为2.0 mM，DNA模板2 μL，补ddH2O至25 μL。 PCR反应条件为94℃预变性3 min，之后94℃变性30 s，50℃ 30 s，72℃30 s，共35循环；终末延伸5 min。取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳观察。

2 结果

2.1 简并引物的设计和靶序列的比对

使用ClustalX 2.1对24株CAEV和7株MVV全基因组进行比对并绘制进化树（图1），在vif基因上筛选出可设计引物的序列，设计简并引物P1和P2，将150 bp的靶序列作为诊断标识序列（图2）；同时，选取具有代表性差异的MVV前病毒基因组L06906.1、AF479638.1和CAEV前病毒基因组KT453988.1、KT749878.1和KY358787.1的PCR靶序列进行基因合成作为扩增模板，其该段序列差异见图2和图3，选定毒株在进化树上的分析见图1。

图1 小反刍动物慢病毒全基因组序列的比对分析

图2 小反刍动物慢病毒全基因组中vif基因上可设计引物的序列

图3 小反刍动物慢病毒PCR扩增中阳性对照序列的比对

2.2 PCR检测方法的建立

使用设计的简并引物P1和P2，以合成序列为模板，按照设定的扩增体系和条件进行扩增，扩增出与预期目的条带 （图4）；并用不同浓度模板 （C001-C005）检测该方法的敏感性，结果发现该方法对AF479638.1_C002模板的敏感性为0.0032 μM，对L06906.1_C001和KT453988.1_C003模板的敏感性为0.08 μM，对 KT749878.1_C004和KY358787.1_C005模板的敏感性为 0.4 μM（表 2），说明该方法具有较好的敏感性。

图4 合成的序列为模板进行PCR扩增

表2 小反刍动物慢病毒PCR扩增方法对合成模板的敏感性测试

2.3 PCR扩增方法的验证

使用 CAEV参考毒株（ATCC VR-905）、山东分离株（KT749878.1）和贵州株（KT749880.1）细胞培养病毒的cDNA和前病毒DNA为模板验证建立的PCR扩增方法，结果显示可以扩增出目标片段，使用山羊滑膜细胞基因组DNA为模板扩增为阴性，并使用已发表的CAEV-R-1和CAEV-F-1引物进行扩增验证该结果，见图5。

图5 建立的PCR扩增方法对CAEV实验室培养物的扩增

同时，以细胞培养的MVV病毒cDNA和前病毒DNA为模板使用建立的方法进行扩增，可以扩增出目标片段；而CAEV-R-1和CAEV-F-1引物对CAEV cDNA和前病毒DNA模板可以扩增目标条带，扩增 MVV模板无结果（图6）。

图6 建立的PCR扩增方法对MVV实验室培养物的扩增

3 讨 论

小反刍动物慢病毒病呈现全球性分布，其中，MVV主要感染绵羊导致进行性肺炎（OPP），CAEV感染山羊则主要表现为慢性多发性关节炎、滑膜炎、滑囊炎和幼畜的脑炎等临床症状，但受感染绵羊和山羊大多呈现隐性感染而无明显临床特征[3,4]，给养羊业带来潜在的健康危害和经济损失，因此被我国农业部列为二类动物疫病，被世界动物卫生组织列为必须通报的疫病，是国际绵羊和山羊进出口贸易必检的动物疫病。我国在上世纪80年代末从进口吐根堡奶山羊和萨能奶山羊中发现并分离了该病毒[13]；但由于该病毒分离培养和批量抗原制备难度较大，近年来国内有关小反刍动物慢病毒病的研究报道较少，兽医临床中也常忽视了该病毒的存在，因此国内山羊和绵羊SRLVs的感染现状和潜在危害尚不清楚，急需建立有效的检测方法获得相关数据，以进一步完善我国当前SRLVs的检疫与防控策略。

目前，世界动物卫生组织（OIE）推荐的检测方法有琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR检测方法，但由于潜伏感染期羊体内的抗体水平较低[14]，AGID和ELISA并不适用感染后的早期诊断，当前国内外多个实验室建立了基于PCR扩增的病原学检测方法，以检测、定量和鉴定病毒RNA和前病毒DNA，根据基因组序列设计的引物进行特异性分析发现，当前所设计的引物可能仅适用于部分基因亚群毒株的检测[11,12]，可能并不适用于开展大规模或区域性流行病学调查。本研究依据已公开CAEV和MVV前病毒基因组序列的比对结果，选取vif基因上约160 bp的序列设计简并引物，并全基因合成代表性差异的3株CAEV和2株MVV靶序列作为模板，初步建立了可同时检测MVV和CAEV DNA的PCR检测方法，对合成模板的检出极限为0.0032-0.40 μM。通过实验室保存的3株CAEV和1株MVV细胞培养物RNA和前病毒DNA为模板初步验证该方法可行。

由于本实验室保存SLRVs毒株数量和来源有限，仅限于部分亚群（B1和A2）的检测，因此尚需开展其它亚群毒株检测效果评估和盲法验证检测方法的可靠性；进一步验证其对临床SLRVs的检测效果，为我国新的SLRVs病原学检测试剂盒的研发和大规模调查提供技术支撑。

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