用于超低过氧化物检测的抗重金属干扰稳定性生物试纸

刘博颖

福建省泉州实验中学 福建泉州 362000

过氧化物作为一种重要且常见的氧化剂，目前已经被广泛用于食品、制药、医学工业和环境分析等领域。（1）但是如果生物体长期接触过氧化物，即使是超低浓度的过氧化物，在长期积累过程中，会造成严重的后果，比如导致基因突变、老年痴呆、动脉硬化等等。（2）因此我们需要在日常生活中对其进行检测。目前市场上已经开发的过氧化物检测方法主要是采用分光光度法、碘化钾试纸法、滴定法和色谱法等，皆有一定的缺点，如价格昂贵、检测能力差、操作复杂和灵敏度低等。（3）因此，我们希望开发一种简便、精确、成本低的检测方法。本文设计了一种新型的抗重金属干扰稳定性生物试纸，采用辣根过氧化物酶作为催化剂，具备反应迅速的优点。（4）考虑到含有过氧化物的溶液中常有重金属离子的存在，我们通过设计试纸结构，可将重金属离子在进入酶催化区域前螯合分离，确保了酶的催化活性。同时考虑到商业应用，酶在长期保存中稳定性较差，因此我们加入多羟基小分子糖对其结构进行保护，提高其保质期。（5）此试纸性价比高，具有较强的市场竞争力[1]。

1 实验

1.1 试剂

辣根过氧化物酶（HRP），2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），海藻糖均购自Sigma公司。其它均为分析纯。

1.2 实验步骤

配置10mL的1mg/mL的HRP溶液，加入10mg，20mg，30mg海藻糖，得到海藻糖酶溶液。制备20mM的ABTS溶液，将其和含有海藻糖的酶溶液按1：10的比例混合，随后取1mL均匀分布于试纸酶反应区域，自然风干。取5mg/mLEDTA溶液1mL，均匀分布于螯合区域，自然风干。

2 结果与讨论

2.1 抗干扰分区试纸的设计

试纸的设计为长方形，尺寸为宽2cm，长8cm，由上到下为酶反应区、层析区、螯合区、加样区。分别为2cm*2cm。酶反应区添加有HRP、ABTS和不同浓度的海藻糖，在过氧化物的存在下，HRP将ABTS催化氧化生成绿色的ABTS·+，而颜色深度和过氧化物浓度成正比，因此通过和标准色的对比，即可知道过氧化物的浓度。螯合区均匀分布有EDTA，可通过螯合作用将重金属截留在该区域。保护了酶不受重金属的干扰。两者之间的层析区，是进一步将酶和重金属隔离开，避免螯合物进入酶反应区域。

2.2 试纸测试结果讨论

在制备了加入小分子糖保护剂的抗重金属干扰的试纸后，首先对其检测能力进行测试。这里我们采用过氧化氢作为典型过氧化物进行实验。如下图1所示，图1a为检测混合有1mg/mL氯化镉和1mg/mL氯化铅的低浓度过氧化氢溶液（0.002%）的结果，图1b为制备的标准对比色。可看到1a中的试纸检测结果与图1b中的标准色对比，颜色介于0.0015%与0.003%之间，结果符合要求。而常规下，出现如此高浓度的重金属离子，酶会立即失活。由此可见，螯合区隔绝了重金属离子和酶的相互接触，保护了酶的活性。

图1 （a）抗重金属干扰分区试纸；（b）标准色对比

随后为了验证海藻糖对酶的保护，我们将含有不同浓度海藻糖的试纸放置在室温的环境中，保持3个月后，进行活性的检测。活性数据如图2。可以发现，在浓度达到2mg/mL以上之时，在保存3个月后，可以实现95%以上的活性保留。再加大糖的浓度意义不大，考虑到性价比，我们可以优先选择2mg/mL的海藻糖。保质期的提升，为该试纸的市场化提高了竞争能力。

图2 稳定性测试

3 结语

本实验设计了一种抗镉离子和铅离子干扰的具备高稳定性的酶检测试纸，并通过显色反应证明了其对低浓度过氧化氢的检测能力。实验结果证明，螯合区域的存在可以将重金属离子剥离，保护酶的活性。同时我们也加入了不同含量的海藻糖进行稳定性的测试，结果证明含有2mg/mL以上海藻糖的酶试纸，稳定性出色，证明了其市场化能力。