ATG16L1与Gal—9在溃疡性结肠炎活动性判定中的价值

吴娜 李多 于永强

[摘要] 目的 探究ATG16L1与半乳糖凝集素-9（Gal-9）对溃疡性结肠炎（UC）活动性判定中的价值。 方法 选择2015年3月～2016年3月河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）进行治疗的80例UC患者为观察组，另选取同期于我院进行结肠镜检查无异常者20例作为对照组，使用改良Mayo评分系统对UC的活动性进行评估。采用Spearman相关分析观察组患者ATG16L1、Gal-9表达水平与Mayo评分的相关性。 结果 观察组ATG16L1的相对表达量和蛋白表达阳性率均显著低于对照组（P < 0.05），观察组Gal-9相对表达量和表达阳性率均显著高于对照组（P < 0.05）。ATG16L1相对表达量和阳性率与Mayo评分呈显著负相关（rs=-0.78，P < 0.05；rs=-0.80，P < 0.05），Gal-9相对表达量和蛋白阳性表达率与Mayo评分呈显著正相关（均rs=0.81，P < 0.05）。 结论 ATG16L1和Gal-9的表达与UC的活性密切相关，可作为判断UC活性的指标。

[关键词] ATG16L1；半乳糖凝集素-9；溃疡性结肠炎；活动性

[中图分类号] R574.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-0066-04

[Abstract] Objective To explore the value of ATG16L1 and galectin-9 （Gal-9） in judging the activity of ulcerative colitis （UC）. Methods From March 2015 to March 2016， 80 patients with UC in the First Affiliated Hospital of Hebei North University （“our hospital” for short） were selected as the observation group， and 20 patients with no intestinal disease over the same period as the control group. The UC activity was evaluated using the modified Mayo scoring system evaluation. Spearman correlation was used to analyze the correlation between the expression level of ATG16L1 gal-9 in the observation group and the Mayo score. Results The relative expression of ATG16L1 and the protein positive expression rate in the observation group were significantly lower than those in the control group （P < 0.05）， and the relative expression of Gal-9 and the positive expression rate in the observation group were significantly higher than those in the control group （P < 0.05）. The relative expression level and positive rate of ATG16L1 showed a significant negative correlation with Mayo score （rs=-0.78，P < 0.05；rs=-0.80，P < 0.05）. The relative expression level of Gal-9 and the protein positive rate showed a significant positive correlation with Mayo score （all rs=0.81，P < 0.05）. Conclusion The expression of ATG16L1 and Gal-9 is closely related to the activity of UC， which can be used as an index to judge the activity of UC.

[Key words] ATG16L1； Galectin-9； Ulcerative colitis； Activity

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）病变部位可遍及整个结肠，其病程长并容易反复发作[1-2]。在治疗过程需对UC的活动性及逆行及时评估和随访，但目前尚无统一判定标准并且缺乏特异性[3]。ATG16L1编码的蛋白参与细胞的自噬，与UC的发生和发展密切相关[4]。而半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）参与机体炎性反应和免疫调节过程，细胞自噬异常会引起Gal-9水平的波动[5]。目前国内鲜见关于Gal-9、ATG16L1与UC活动性的相报道，本文主要研究Gal-9、ATG16L1对与UC活动性判定中的价值，为Gal-9、ATG16L1指导UC的临床治疗提供新的治疗方法及依据。现将报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般資料

选取2015年3月～2016年3月河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）80例UC患者为观察组，其中男43例，女37例；平均年龄（40.56±4.43）岁。另选取同期于我院进行结肠镜检查无异常者20例作为对照组，男11例，女9例，平均年龄（38.22±4.07）岁。两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究已经我院医学伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①年龄在20～80岁；②符合2012年炎症性肠病诊断与治疗的共识意见[6]中对于UC的诊断标准；③各项检查资料完整；④患者及患者家属均签署知情同意书。排除标准：①过去3个月内使用过水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等；②合并心血管疾病和肝肾疾病；③合并恶性肿瘤；④合并其他自身免疫性疾病；⑤哺乳以及妊娠期妇女。

1.3 方法

1.3.1 疾病活动性评估 本次研究中使用改良Mayo评分系统[7]对UC的活动性进行评估，评估项目包括：排便次数、便血情况、内镜表现以及总体评价，根据患者实际情况与患者健康时自身情况，每项进行0～3分的评分，总分为12分，分数越高表示越严重。根据评分可分为：①临床缓解期≤2分；②轻度活动3～5分；③中度活动6～10分；④重度活动11～12分。

1.3.2 ATG16L1、Gal-9相关PCR检测 所有患者在结肠镜检查时分别采集结肠黏膜标本3份，其中1份使用荧光定量PCR方法进行检测，具体操作方法如下[7-8]：将标本在液氮保护下研磨，使用逆转录反应试剂盒提取总RNA，试剂盒购买于Takara公司（RT-reagent），荧光定量PCR反应试剂盒购买于Takara公司（SYBRPremixExTaq）严格按照说明书方法操作。扩增体系为1 L cDNA加入到10 L去离子水，95℃预变性1 min；变性：95℃下15 s，退火：60℃下30 s，延伸：72℃，共进行40个循环，比较。ATG16L1上游引物5′-GGCTGTACCGTGTTTCCT～TAG-3′，下游引物5′-CTTCATGGCAAGTGG-TTGTAC-3′；Gal-9上游引物5′-GGCTGTACCGTGTTTCCT～TAG-3′，下游引物5′- GTGAAGGTGACAGCAGTCGGT-T-3′均為自行设计。

1.3.3 ATG16L1、Gal-9相关免疫组化检测 将“1.3.2”中另两份样本及逆行免疫组化检测，具体方法如下：将样本及逆行固定、脱蜡处理，3%过氧化氢室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，后用PBS冲洗，再放入枸橼酸钠缓冲液高压煮沸2 min，后用PBS冲洗。分别滴加小鼠抗人ATG16L1、Galectin-9单克隆抗体（购买于上海信裕生物科技有限公司），阴性对照用PBS代替，4℃孵育24 h。复温40 min，PBS冲洗，滴加鼠二抗工作液，室温孵化1 h后PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，室温15 minPBS冲洗。DAB显色10 min，显微镜下控制反应时间，显色满意后自来水冲洗，后用苏木精复染。清水冲洗后氨水返蓝，封片。每张切片随机选取8个高倍视野，细胞颜色包括无色、浅黄色、黄色、棕黄色和棕褐色，着色比例大于30%并且颜色为黄色、棕黄色、棕褐色的细胞为阳性细胞，表达阳性率用每个视野中阳性细胞比例表示，阳性率=（视野中阳性细胞个数/视野中总细胞数）×100%，取8个视野的平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman相关分析观察组患者ATG16L1、Gal-9表达水平与Mayo评分的相关性，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组ATG16L1、Gal-9的mRNA相对表达量比较

观察组ATG16L1的相对表达量显著低于对照组（P < 0.05），观察组Gal-9相对表达量显著高于对照组（P < 0.05）。见表1。

2.2 两组ATG16L1、Gal-9蛋白表达阳性率比较

观察组ATG16L1蛋白表达阳性率显著低于对照组（P < 0.05），观察组Gal-9蛋白表达阳性率显著高于对照组（P < 0.05）。见表2。

2.3 观察组不同UC活动性ATG16L1、Gal-9的mRNA相对表达量比较以及相关性比较

随着Mayo评分的升高，TG16L1以及Gal-9相对表达量显著升高，其中ATG16L1相对表达量与UC活动性呈显著负相关（rs=-0.78，P=0.000），Gal-9相对表达量与UC活动性呈显著正相关（rs=0.81，P=0.000）。见表3。

2.4 观察组不同UC活动性ATG16L1、Gal-9蛋白表达阳性率比较以及相关性比较

观察组内不同UC活动性组间的ATG16L1、Gal-9表达阳性率差异有统计学意义（P < 0.05），随着Mayo评分的升高，TG16L1以及Gal-9阳性率显著升高，其中ATG16L1表达阳性率与UC活动性呈显著负相关（rs=-0.80，P=0.000），Gal-9表达阳性率与UC活动性呈现显著正相关（rs=0.81，P=0.000）。见表4。

3 讨论

近年来调查发现UC在我国的发病率呈上升趋势[9]。UC的治疗目的是达到结肠黏膜的愈合，而UC是一种病程长、极易反复发作的疾病，其活动性治疗过程中处于不断变化的过程中，因此对于UC治疗过程中，对UC活动性评估对治疗有着重要的指导作用，肠镜检查虽较直观，但缺乏客观性，并且过程较为繁琐。Mayo评分虽被广泛的应用于临床，但是其缺乏直观性，并且评估结果极易受到影响[10]。研究表明UC属于不明原因的非特异性炎性疾病，与肠道免疫系统异常密切相关[11]。自噬可通过溶酶体清除受损的细胞器以及死亡细胞等，不会引起炎性反应[12]。ATG16L1编码的蛋白是与自噬过程中最重要蛋白当ATG16L1表达异常会扰乱细胞自噬过程，导致炎性发生[13]。研究表明ATG16L1基因多态性与IBD的发生密切相关[14]。本研究结果提示不同UC活动性的患者中，ATG16L1的mRNA相对表达量与ATG16L1表达阳性率存在显著差异，其水平与Mayo评分呈显著负相关。自噬缺陷可能会引起炎性反应，甚至加剧自身免疫性疾病，研究推测自噬异常会导致DC递呈微生物抗原到达肠淋巴细胞，使T细胞激活受损且分泌炎性因子减少，从而导致肠道内稳态失衡，诱发UC[15-16]。本研究结果提示ATG16L1表达水平在UC活动性判定中具有一定价值。

细菌感染也是导致UC的重要原因，肠黏膜受损细菌侵入引会起免疫反应[17]。既往研究表明，在正常生理条件下Gal-9表达极少，但在一些炎性因子IFN-γ、IL-1β等的刺激下表达增加[18]。近年来研究表明，弯曲菌侵入可诱发UC，并使单层肠上皮表达Gal-9的水平显著增高，同时ATG16L1表达异常导致炎性也会引起Gal-9的水平升高[19]。本研究结果提示不同UC活动性的患者中，Gal-9的mRNA相对表达量与表达阳性率存在显著差异，其水平与Mayo评分呈显著正相关。IFN-γ、IL-1β可通过激活细胞及B细胞，促进产生下游细胞因子，从而发挥免疫上调作用，同时也可以促进炎症细胞释放炎性因子，发挥促炎症作用，说明Gal-9可作为一种反应UC活动性的评价指标[20]。

综上所述，UC患者ATG16L1、Gal-9表达水平存在显著异常，并且不同UC活动性间的ATG16L1、Gal-9表达水平存在显著差异，ATG16L1表达水平与Mayo评分呈现显著的负相关关系，Gal-9表达水平与Mayo评分呈现显著的正相关关系，可作为判定UC活动性的指标。

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