甲状腺恶性潜能未定的高分化肿瘤差异表达蛋白的蛋白质组学分析

唐铭 杨慧 刘鹏杰 徐敏洁 张迎红 陈天星

[摘要] 目的 篩选与鉴定甲状腺恶性潜能未定的高分化肿瘤（WT-UMP）差异表达蛋白质分子，寻找新的蛋白质标志物。 方法 收集2015年1月～2016年12月云南省第一人民医院（以下简称“我院”）手术切除新鲜标本甲状腺WT-UMP 20例及其周围正常甲状腺组织20例，另收集2016年1～12月我院病理科甲状腺乳头状癌（PTC）蜡块30例。从冰冻新鲜样本中分别提取总蛋白进行双向凝胶电泳（2-DE），经PDQuest 7.3图像分析软件检测表达差异点，利用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和SWISS-PROT数据库对差异蛋白进行鉴定，通过PANTHER分析对差异蛋白进行分类，选择其中5种差异表达蛋白通过免疫组织化学染色进行验证。 结果 共鉴定出27种差异蛋白，在甲状腺WT-UMP中呈高表达的25个，呈低表达的2个。免疫组化染色显示5种蛋白Cytosolic non-specific dipeptidase（CNDP2）、Cytokeratin18（CK18）、Cathepsin B（CTSB）、Calreticulin（CRT）及Annexin A5（ANXA5）均定位于细胞浆。CK18、CTSB、CRT及ANXA5这4种蛋白的表达在WT-UMP中均高于正常甲状腺，差异有统计学意义（P < 0.05），在PTC中均高于WT-UMP，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 成功筛选了甲状腺WT-UMP差异表达蛋白质分子，这些蛋白质表达的改变，可能参与了WT-UMP的发生和发展。同时通过免疫组化的验证，有利于WT-UMP的早期诊断。

[关键词] 甲状腺恶性潜能未定的高分化肿瘤；差异表达蛋白；蛋白质组学；蛋白质标志物

[中图分类号] R365 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（a）-0060-06

[Abstract] Objective To identify the differential expression proteins in thyroid well-differentiated tumour of uncertain malignant potential （WT-UMP） and to look for new protein biomarkers. Methods A total of 20 thyroid WT-UMP resection samples and 20 normal thyroid tissues adjacent to thyroid WT-UMP were obtained from January 2015 to December 2016 in the First People's Hospital of Yunnan Province （hereinafter referred to as "our hospital"）. In addition， 30 blocks papillary thyroid carcinoma （PTC） were obtained from the pathology department of our hospital from January to December 2016. The total proteins which were extracted from frozen thyroid samples in each group were profiled with two-dimensional electrophoresis （2-DE）. The differential protein spots were identified by PDQuest 7.3 software and identified by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-fight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS） and SWISS-PROT database. The different proteins were classified by PANTHER analysis and five differentially expressed proteins of these spots were further validated through immunohistochemistry （IHC）. Results 27 proteins were identified with MS. There were 25 high expression and 2 low level expression proteins in thyroid WT-UMP. IHC revealed the following five proteins located in the cytoplasm： cytosolic non-specific dipeptidase （CNDP2）， cytokeratin 18 （CK18）， cathepsin B （CTSB）， calreticulin （CRT） and annexin A5 （ANXA5）. Four kinds of proteins include CK18， CTSB， CRT and ANXA5 were over-expressed in thyroid WT-UMP compared with normal tissues， the difference was statistically significant （P < 0.05）； Meanwhile， the four proteins were over-expressed in PTC compared with thyroid WT-UMP （P < 0.05）. Conclusion The differentially expressed protein molecules were successfully screened and identified in thyroid WT-UMP. The changes of these proteins expression may be involved in the genesis and development of thyroid WT-UMP. The newly identified protein biomarkers can positively contribute to early thyroid WT-UMP diagnosis by using IHC.

[Key words] Thyroid well-differentiated tumour of uncertain malignant potential； Differentially expressed protein； Proteomics； Protein markers

2017年第四版内分泌肿瘤WHO分类提出了甲状腺交界性肿瘤的概念。这类肿瘤具有非常惰性的生物学行為，而且治愈率高，无需追加RAI治疗[1]。准确诊断这类肿瘤将减少对患者侵袭性的治疗、减轻其心理压力并降低社会经济负担。恶性潜能未定的高分化肿瘤（WT-UMP）属于甲状腺交界性肿瘤的其中一种类型，是一种全由或部分具有乳头状甲状腺癌核改变和可疑包膜或血管侵犯的、高分化滤泡细胞组成的有包膜或境界清楚的肿瘤。在HE形态上有时与甲状腺乳头状癌（PTC）难以鉴别。为了更加准确的诊断WT-UMP，本研究采用双向电泳和质谱技术，通过数据库搜索鉴定WT-UMP的差异表达蛋白，并选取5种蛋白进行免疫组化验证以期获得可用于临床病理诊断的特异蛋白质标志物，对WT-UMP的早期诊断及鉴别诊断提供理论和实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月～2016年12月云南省第一人民医院（以下简称“我院”）手术切除新鲜的甲状腺标本，其中WT-UMP20例，其周围正常甲状腺组织20例。新鲜标本均置于-80℃冻存，用于双向凝胶电泳（2-DE）检测。所有标本均经石蜡切片进行组织病理学确诊。另收集2016年1～12月我院病理科明确诊断的甲状腺乳头状癌蜡块30例。

WT-UMP诊断标准：参照2017版WHO内分泌肿瘤分类。肿瘤边界清楚，有或无包膜，全部或部分具有毛玻璃样的核，无明确包膜、血管侵犯，无淋巴结转移。

正常甲状腺诊断标准：参照人民卫生出版社2013年出版的第8版《组织学与胚胎学》。滤泡由单层滤泡上皮围绕胶质构成，滤泡上皮细胞因功能状态不同呈扁平、立方或柱状。取材时切取WT-UMP旁3 cm以上甲状腺组织作为正常的甲状腺组织。

PTC诊断标准：参照2017版WHO内分泌肿瘤分类。肿瘤组织呈分枝乳头状，常伴有不规则的滤泡，具有PTC样细胞核的特征（细胞核增大、核排列拥挤重叠、核轮廓不规则、毛玻璃样核、核沟、核内假包涵体等），有包膜或血管的侵犯。

1.2 试剂

动物组织裂解液及PMSF购自上海碧云天生物技术公司；干胶条购自美国Bio-Rad公司；考马斯亮蓝购自美国MP Biomedicals公司；CK18及MaxVision2二抗试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；CTSB、CNDP2及ANXA5购自Abcam；CRT购自R&D; systems。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取 同组样本等量混合后每组取0.1 g样本，加液氮研磨成粉，加入1 mL含蛋白酶抑制剂PMSF的裂解液，离心后取上清。加入-20℃冷丙酮，冷却、离心后取沉淀。适量水化液重溶沉淀，-70℃冰箱保存。经Bradford法测蛋白质样品浓度。

1.3.2 双向电泳 取500 μg样品蛋白与水化液混合，加入1 μL IPG Buffer混匀，总体积500 μL，取IPG预制干胶条被动水化上样12 h。将上好样的胶条转移至聚焦盘中进行一向等电聚焦电泳。聚焦完毕后，立即将胶条依次置于含DTT的平衡缓冲液Ⅰ、含IAA的平衡缓冲液Ⅱ中各平衡15 min，然后进行双向SDS-PAGE电泳，固定后行考马斯亮蓝染色。用Expression 10000 XL扫描凝胶图像，采用PDQuest 7.3图像分析软件在相同参数设置下，对WT-UMP组和正常甲状腺组的2-DE图谱进行差异蛋白分析，将差异倍数3倍及以上的点定义为差异蛋白差异点。

1.3.3 质谱鉴定 利用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析对差异蛋白点进行鉴定，获取一级和二级肽指纹图谱，使用GPS Explorer（V3.6）软件对质谱数据分析，然后进行SWISS-PROT数据库检索，进一步确定蛋白质。一级质谱和二级质谱综合可信度达到95%为可信的鉴定结果。

1.3.4 免疫组化染色 20例WT-UMP、20例正常甲状腺及30例PTC均用MaxVision法进行IHC染色（按说明书进行操作）。结果判读以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，综合染色强度及阳性细胞数量进行半定量分析。染色强度评分：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞所占百分比评分：<5%记0分，5%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分。两项结果相加，总得分：0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。所有病例的免疫组化结果由两位高级职称病理医师采用双盲法进行评估。

1.3.5 统计学方法 采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，等级资料比较采用秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双向电泳

通过2-DE技术得到WT-UMP和正常甲状腺的2-DE电泳图谱（图1）。两组图谱相比较，共发现41个差异蛋白点。其中38个蛋白质表达上调，3个下调。

2.2 质谱结果

通过MALDI-TOF-MS分析，41个差异蛋白点均成功获得一级和二级肽指纹图谱，CK18一级和二级肽指纹图谱。见图2。经SWISS-PROT数据库检索，去除鉴定结果相同的蛋白点，共鉴定出27种蛋白质。见表1。与正常甲状腺比较，在WT-UMP中有25个上调蛋白，2个下调蛋白（ALB、LMNA）。

2.3 生物信息学分类

根据PANTHER分类分析及功能注释，对质谱鉴定出的27种蛋白进行生物信息分析。按分子功能分类，多数蛋白（43.5%）的分子功能为催化活性，如CNDP2具有金属蛋白酶活性，这说明WT-UMP的发生发展是一种生物变化的过程，需要酶类的参与。其次，22.1%的蛋白具有结构分子活性，可能与细胞外基质、角蛋白、髓鞘、核糖体的构成相关，这类蛋白构成了细胞的基本骨架。其他蛋白具有载体活性（6.4%）、抗氧化活性（3.2%）、連接（14.2%）、酶调节活性（6.8%）和受体活性（3.8%）。按生物学途径分类，31.2%的蛋白参与代谢途径，其次22.6%蛋白与细胞间联系、细胞周期、细胞生长、细胞增殖、细胞识别等细胞过程相关，说明这类蛋白与WT-UMP的发生、发展相关，如：ANXA1、CK18、γ-actin等。其他相关生物学途径还有应答反应（8.5%）、凋亡过程（1.7%）、生物学调控（4.2%）、细胞组分形态发生与组成（12.1%）、发育过程（11.4%）、免疫系统过程（1.6%）和定位（6.7%）。按细胞组份分类，86.4%的蛋白分布在细胞内（包含细胞浆及细胞器），9.1%分布在细胞外区，4.5%为大分子复合物。

2.4 免疫组化染色结果

本研究选取5种蛋白（CNDP2、CK18、CTSB、CRT及ANXA5）进行免疫组化染色，5种蛋白抗体染色均定位于胞浆，其中CTSB、CRT及ANXA5也在胞膜中表达。结果显示，CK18、CTSB、CRT及ANXA5这4种蛋白的表达在WT-UMP中均高于正常甲状腺（P < 0.05），在PTC中均高于WT-UMP（P <0.05 ），CNDP2均无明显差异。五种蛋白的表达结果见表2。CK18及CRT在三组中的表达见图3（封三）。

3 讨论

蛋白质组（proteome）的概念最早由Marc Wilkins提出，是指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质[2]。近20年来，作为一种高通量、高灵敏度的技术，蛋白质组学（proteomics）已被广泛应用于各种恶性肿瘤的临床研究。以往对于PTC的发生、发展、转移以及预后的相关蛋白及基因的研究已经取得了重大的进展[3-4]，但对于交界性肿瘤的认识及研究均较为匮乏。本研究采用2-DE质谱分析，同时筛选出差异蛋白，并用免疫组化的方法进行验证，为甲状腺交界性肿瘤的临床病理诊断及鉴别诊断提供理论依据。

质谱共鉴定出27种蛋白质，由于鉴定出的蛋白数量较多，本实验挑选出5种相对含量较高且重复性较好的蛋白（CNDP2、CK18、CTSB、CRT及ANXA5）进行免疫组化染色。免疫组化结果显示：CNDP2在三组中的表达均呈阴性或弱阳性，三组间无统计学差异。CK18、CTSB、CRT在WT-UMP中均以中等至强阳性染色为主，在PTC中均以强阳性染色为主。ANXA5在WT-UMP中呈弱至中等阳性染色，在PTC中呈中等至强阳性染色。CK18、CTSB、CRT及ANXA5在WT-UMP与正常甲状腺间及WT-UMP与PTC间均存在差异，具有统计学意义。同时，这四种蛋白的染色强度在三组中均呈递增形势，说明它们对WT-UMP的发生发展起到一定作用，WT-UMP与PTC在蛋白质水平具有正相关性。

CK18分布于上皮细胞，属于细胞骨架蛋白家族。在临床病理诊断工作中，CK18是辅助诊断腺上皮、间皮和尿路上皮源性肿瘤的有用指标[5]。有文献报道，CK18宜作为甲状腺癌浸润和转移的标志物[6]。本研究中，CK18在正常甲状腺中主要呈阴性或弱阳性表达，在WT-UMP中以中等至强阳性表达为主，与正常甲状腺比较在各个程度的表达都具有统计学差异，在PTC中以强阳性表达为主，与WT-UMP比较在中等阳性及强阳性表达时具有统计学差异。因此，只有当CK18呈强阳性表达时，对鉴别正常甲状腺、WT-UMP和PTC之间有较好的应用价值。

组织蛋白酶B（CTSB）是溶酶体内半胱氨酸组织蛋白酶，属于木瓜蛋白酶家族。该酶广泛参与蛋白质的降解，并与细胞凋亡有着密切的联系[7-8]。研究表明CTSB与肿瘤血管生成相关因子MMP-9有明显关系，在乳腺癌、肺癌、头颈部癌等多种恶性肿瘤中表达上调[9-10]。已有文献分析了PTC和正常甲状腺组织的蛋白质组学，结果显示：CTSB在PTC中的表达高于正常甲状腺[11-12]。本研究中，蛋白质组学及免疫组化染色均显示CTSB在WT-UMP中的表达高于正常甲状腺，同时免疫组化结果显示CTSB在PTC中的表达显著高于正常甲状腺及WT-UMP，这与以往研究结果一致。CTSB参与裂解基质、基底膜的过程，促进肿瘤细胞的生成。因此该酶可作为一种可行的标志物用于PTC与WT-UMP的鉴别诊断。

CRT最先由Ostwald和Maclennan于1974年从骨骼肌肌浆网中首次分离获得，是一种普遍存在且高度保守的内质钙结合蛋白，具有多种生物学功能，包括参与肿瘤抗原提呈、血管的发生及细胞的凋亡等。CRT表达量的改变可以使细胞的侵袭、黏附、增殖等生物学行为发生改变，与肿瘤的发生发展及预后密切相关[13]。近年许多研究发现，多种肿瘤中CRT及其裂解片段有量的改变，如肺癌、肝癌、食管癌、子宫内膜样腺癌等，这些研究均表明CRT有望成为多种肿瘤的新标志物，有利于协助恶性肿瘤的早期诊断[14]。ANXA5是膜联蛋白家族中的一员，其功能主要有作为钙通道、抗炎抗凝血、促进细胞凋亡等[15]，有报道显示：ANXA5可促进肿瘤的恶化，其表达上调与乳腺癌的分期呈正相关[16]。关于CRT及ANXA5这两种蛋白在甲状腺肿瘤中表达水平的研究报道不多，也有少许文献[17-18]对膜联蛋白家族其他蛋白在甲状腺肿瘤中的表达做了研究，结果显示膜联蛋白家族各成员的表达水平不尽相同，ANXA3在PTC中的表达水平低于正常组，然而ANXA4在PTC中的表达水平均高于结节性甲状腺肿和癌旁正常甲状腺组织。本研究的双向电泳结果显示，相对于正常甲状腺，CRT及ANXA5在WT-UMP中的表达量均上升，同时免疫组化结果也验证了这一结论。因此，从这两种蛋白的功能联系本研究结果，CRT及ANXA5可能与WT-UMP的发生发展有关，可作为PTC与WT-UMP鉴别诊断有用的蛋白标志物应用于临床病理诊断。

CNDP2是雙肽金属蛋白酶，是M20家族成员，具有肌肽酶的活性。CNDP2在不同的肿瘤中具有表达差异性。例如在乳腺癌、肾细胞癌和结直肠癌中，CNDP2均显著高表达，而在胰腺癌和胃癌中，CNDP2则普遍低表达，甚至可能担当一个抑癌基因的角色[19-20]。在本研究中，CNDP2在WT-UMP及PTC两组中的表达以阴性或弱阳性为主，在正常甲状腺组中80%以上不表达，三组间无统计学意义。但质谱结果显示，WT-UMP组CNDP2蛋白上调。实验结果的不一致可能与样本量较小有关，因此有待更多的标本量去验证。

综上所述，CK18、CTSB、CRT及ANXA5这四种蛋白对WT-UMP的诊断及鉴别诊断均具有一定的临床应用价值。

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