冠状动脉CT成像不同管电压对外周血淋巴细胞DNA双链断裂影响的研究

林竹潇， 张龙江， 周长圣， 周帆， 顾海峰， 鲍雪芹， 卢光明

冠状动脉CT成像(coronary CT angiography，CCTA)已成为疑似冠心病患者的首选影像检查方法[1-3]，但是伴随而来的是人群辐射暴露的增加。目前有多种技术，如降低管电压和管电流、适当的前置滤过器、ECG调制电流技术、增加螺距及层面厚度等可用于降低CCTA的辐射剂量[4-7]，其中降低管电压是降低辐射剂量最有效的方法。

辐射剂量的评估常用有效剂量(effective dose，ED)、CT容积剂量指数(volume CT dose index，CTDIvol)、剂量长度乘积(dose-length product，DLP)及水当量体型特异性剂量估算值(water equivalent size specific dose estimate，water equivalent SSDE)等指标，其对人体辐射的评价存在±40%的不确定性，而生物学指标更能直接地反映辐射风险[8]。在生物学评价指标中，DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)是反映辐射的生物学损伤最有价值的表现[9]。DNA损伤信号反应通路存在多种蛋白，其中磷酸化的H2AX(γ-H2AX)蛋白和共济失调毛细血管扩张突变(ataxia telangiectasia-mutated，ATM)蛋白可以作为DNA双链断裂的标记物[10]。目前大部分研究采用免疫荧光显微镜作为检测γ-H2AX焦点的方法，但流式细胞仪分析DNA双链断裂的结果更客观、实验周期更短[11]。本研究旨在利用流式细胞仪评价不同管电压的CCTA对DNA双链断裂的影响。

材料与方法

1.研究对象

本研究采用前瞻性设计，选取2016年4月-2017年7月间行CCTA检查的患者120例，随机分为A、B、C、D四组，分别行管电压为120 kV、100 kV、80 kV及70 kV的CCTA扫描。研究对象纳入标准：年龄大于18周岁、体质量指数<25 kg/m2、未患淋巴瘤或白血病、6个月内未行放射治疗或化疗、1周内未接受X线或核医学检查。因样本保存条件欠佳，排除3例患者后，最终117例患者纳入本组研究。本研究已通过伦理委员会审查许可，研究对象均签署知情同意书。

2.检查方法

所有纳入患者的CT扫描均采用第二代双源CT扫描仪(Somatom Definition Flash，Siemens Healthineers，Forchheim，Germany)。CT扫描经定位像确定扫描范围后，利用Lrich双筒高压注射器向患者外周静脉内注射非离子对比剂优维显60 mL(370 mg I/mL)，注射流率5 mL/s；延迟时间应用人工智能触发扫描系统确定，将兴趣区投至升主动脉，当CT值达到100 HU即可触发扫描。A、B、C、D四组管电压分别为120 kV、100 kV、80 kV、70 kV；其余参数保持一致：管电流280 mA，机架旋转时间0.28 s；四组扫描范围相同。

3.血样处理

每位患者于检查前及检查后20 min分别抽取血液2 mL装入肝素抗凝管，并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)1:1稀释。将稀释的血液置于外周血淋巴细胞分离液(MP Biomedicals，Solon，OH)之上，在离心机内以2100 rpm离心30 min后，用吸管洗出淋巴细胞层，并用PBS清洗2遍。将细胞密度调整为1×106个/ml，4%多聚甲醛4℃固定过夜。用PBS洗去固定液(1200 rpm离心，5 min)后，以0.1% Triton X-100冰上处理细胞5 min，并再用PBS洗涤细胞2次(1200 rpm离心，5 min)。最后使用FITC-CD3抗体(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)、APC-γ-H2AX抗体(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)及PE-ATM抗体(Millipore，Billerica，MD)孵育重悬细胞，室温下避光保存30 min。

4.流式检测

用流式细胞仪(FACScanto，BD Bioscience)对样品进行检测。首先圈出CD3+T淋巴细胞群体，再根据阴性管设置阈值，并对APC及PE两种荧光进行补偿调整；每管样品均计数104个CD3+T淋巴细胞，最后分别计算标记了γ-H2AX及ATM两种蛋白的细胞占CD3+ T淋巴细胞的百分比。

5.统计学分析

结 果

1.人口学特征

A、B、C、D四组间的年龄、性别、身高、体重及体质量指数差异均无统计学意义(P值分别为0.195、0.836、0.998、0.947及0.204，表1)。

2.组内比较结果

在不同管电压下，检查后与检查前相比，A、B、C、D四组γ-H2AX和ATM阳性细胞百分比均升高，四组检查后与检查前结果比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。经CCTA检查后，四组γ-H2AX阳性细胞百分比改变值的中位数分别为2.2%、1.6%、0.8%、1.9%，ATM阳性细胞百分比改变值的中位数分别为2.6%、2.2%、2.3%、4.7%(表2，图1)。

表1 A、B、C、D四组间的人口学特征

表2 A、B、C、D四组间γ-H2AX及ATM阳性细胞百分比及检查前、后差值

图1 不同管电压条件下，CCTA检查后与检查前相比，γ-H2AX 与ATM阳性细胞百分比均升高，表示P<0.05。a) CCTA检查前、后γ-H2AX阳性细胞百分比； b) CCTA检查前、后ATM阳性细胞百分比。

3.组间比较结果

随着管电压由120 kV降低至80 kV，γ-H2AX阳性细胞百分比的差值逐渐下降，进一步降低至70 kV，γ-H2AX阳性细胞百分比的差值上升；两两比较结果显示，除A组与C组(P=0.007)、B组与C组之间(P=0.003)差异有统计学意义外，其余组间差异均无统计学意义(P值均>0.05)，D组的阳性细胞百分比的差值与其他三组间差异均无统计学意义。管电压为70 kV时，ATM阳性细胞百分比的差值最大，管电压为100 kV时，ATM阳性细胞百分比的差值最小，四组间阳性细胞百分比的差值的差异无统计学意义(P=0.381，表2，图2)。

讨 论

本研究结果证实CCTA管电压降低至80 kV能够有效减少DNA双链断裂。另外，管电压由120 kV降低至100 kV后未见DNA双链断裂显著减少；同时，70 kV管电压的应用并没有明显降低DNA双链断裂。

图2 四组间CCTA检查后与检查前γ-H2AX及ATM阳性细胞百分比的差值比较，表示P<0.05。γ-H2AX阳性细胞百分比的差值，除A组与C组(P=0.007)、B组与C组间(P=0.003)差异有统计学意义外，其余组间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。四组间ATM阳性细胞百分比的差值的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

CCTA检查后γ-H2AX水平会升高[12]，有研究表明，即使是非常低的辐射剂量(约1 mGy)，也可以诱导细胞中DSBs的发生[13]。因此在实际检查过程中，通常会采用多种技术降低CCTA的辐射剂量；其中，降低管电压是降低辐射剂量的主要方法[14-16]，目前已经实现最低至70 kV的CCTA扫描[17-18]。有研究认为，尽管管电压的降低会造成图像噪声的增加，但在同时采取其他措施(如自动曝光控制、重建方法等[19-21])的条件下，最终没有引起图像质量的明显降低。然而，管电压的降低使射线穿透力下降，被人体吸收的散射线增加。有研究证实，相比于高管电压(140 kV)，低管电压(80 kV)引起了DNA双链断裂增加[22]。本研究结果显示，管电压为80 kV时，发生DNA双链断裂的细胞最少，随着管电压进一步降低至70 kV，发生DNA损伤的细胞增多。两项研究结果存在差异的原因可能是扫描条件和检测手段的不同；前者在降低管电压的同时提高管电流，与后者保持管电流一致相比，可能会造成辐射损伤的增加。虽然多数研究采用免疫荧光显微镜进行DNA双链断裂的检测，而且敏感性可能高于流式细胞术；但已有文献证实，流式细胞术的敏感性可满足临床上DNA损伤的检测要求[23]；Nguyen等[10]也认为，应用流式细胞仪检测T淋巴细胞中发生DNA双链断裂的细胞比例变化同样能够反映DNA损伤与辐射剂量的关系，并且检查前后ATM阳性细胞百分比改变程度高于γ-H2AX的结果也与文献报道一致。本研究结果进一步证实，γ-H2AX较ATM更能检测不同管电压之间的区别，是一种检测DNA双链断裂更敏感的指标。

综上所述，本研究结果显示经流式细胞仪检测发现将管电压降低至80 kV时，DNA双链断裂降至最低；而进一步降低管电压至70 kV，DNA双链断裂出现上升趋势。因此，通过降低管电压的方法降低CCTA的辐射剂量，应将管电压降低至80 kV为宜。

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