台州市本地感染登革病毒分子分型及溯源分析

王东红 裘丹红 翁坚 盛莹 林海江 林春萍 孔超 周静晓 沈伟伟

318000 台州市疾病预防控制中心(王东红、裘丹红、翁坚、盛莹、林海江、沈伟伟)；318020 台州市黄岩区疾病预防控制中心(林春萍、孔超、周静晓)

登革病毒(dengue virus, DENV)是单股正链RNA病毒，含有一个长的开放读码框，编码7种非结构蛋白(NS2A、NS2B、NS1、NS3、NS4B、NS4A和NS5)和3种结构蛋白(E、C和prM)[1]。基因组全长约11 kb，其中E基因全长1 485 bp，编码E蛋白相对分子质量54.5×103，E蛋白是重要的抗原成份，与受体识别有关。E基因区域的重组对病毒的适应性及进化具有潜在意义，也是登革病毒分型的依据[2-3]。

本研究针对2016年10月在浙江省台州市黄岩区暴发的3例登革热病例进行研究。这3例患者经实验室诊断为I型登革病毒感染，采集患者急性期血清分别进行了NS1抗原检测、IgM、IgG抗体和核酸检测；用白蚊伊蚊细胞(C6/36)分离培养，PCR扩增3株病毒的E基因序列并与NCBI中已公布的基因序列进行比对并进行进化分析，探讨其输入来源与基因型别。

1 材料与方法

1.1材料登革患者急性期血清。登革热NS1快速检测试剂、登革热IgM/IgG快速检测卡购自深圳市科润达生物工程有限公司、磁珠法提取RNA试剂盒(life technology: Amb18365)、DMEM培养基、1640培养基、谷氨酰胺、青链霉素、胎牛血清购自杭州昊天生物技术有限公司；C6/36细胞由本实验室保存。

1.2方法

1.2.1 血清学检测：应用登革热NS1快速检测试剂、登革热IgM/IgG快速检测卡对采集的血清进行检测，检测操作和实验结果判断参照试剂说明书。

1.2.2 病毒分离：将患者急性期血清，按照1∶10稀释，取100 μl接种到长成单层的C6/36细胞分离培养。28℃吸附1 h，弃掉上清，加入含有1%胎牛血清的1640培养基，置28℃培养箱中培养。从第二天开始观察细胞病变情况，一般需要培养7 d才能观察到细胞病变，如果没有病变，则盲传3代接种细胞，盲传3代无细胞病变则为阴性。

1.2.3 登革病毒型别鉴定：取100 μl病毒分离培养液，采用磁珠法提取病毒RNA，操作步骤见说明书。引物采用通用和特异性荧光对登革病毒进行型别鉴定。引物序列和反应条件参考登革热诊断标准(WS 216-2008)。

1.2.4 E基因序列测定：E基因扩增引物参考文献[4]，F1: 5′-GCTTTGCGACACCCAGGATTC-3′；R1: 5′-GCACEAGTCAACGCAGTG-3′；F2: 5′-GCAAAGAAGCAGGAAGTAGTCGTA-3′；R2: 5′-TGCTGATAGTCTTTTTGGGGAGTC -3′。引物由北京六合华大基因有限公司合成。用一步法RT-PCR对提取的病毒RNA进行扩增，扩增条件为：50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，45个循环后，72 ℃延伸7 min。扩增的全长E基因片段经纯化，送北京六合华大基因有限公司测定。

1.2.5 系统进化树的构建：测得的E基因片段采用Seqman(7.1.0)软件进行拼接。用BLAST分析其一致性最高的基因序列来源，用MEGA6.0软件采用相邻连接法(Neighbor-Joining Method)对E 基因序列进行进化分析。从GenBank查找24株DENV-I国内外流行株和参考株的E基因序列进行进化分析[5]，以DENV-3作为树外对照株(GenBank ID: AY744678)。

2 结果

2.1病毒分离用C6/36细胞对3例登革病毒急性期血清进行病毒分离培养，培养5 d后，细胞出现融合，空泡、肿胀、细胞坏死和脱落等细胞病变现象。共分离出3株登革病毒。细胞接种病毒前(图1 A)和接种病毒5 d后(图1B)的状态见图1。

A,接种前；B,接种后5 d
图1 患者血清标本接种C6/36细胞后出现细胞病变
A,Before incoulation;B,5 d after inoculation
Fig.1 Cytopathic effects of C6/36 cell lines caused by inoculation of serum samples from patients

2.2患者基本信息及登革病毒特异检测结果通过荧光RT-PCR对登革病毒进行分型，所有的登革病毒均为DENV-I型。对3例登革病例进行NS1抗原、IgM/IgG抗体和核酸进行检测，检测结果如表1所示。

表1 3例登革病例实验室检测结果

Tab.1Laboratory test results of three dengue fever cases

2.3E基因序列测定结果3株病毒E基因全长均为1 485个核苷酸，编码495个氨基酸。核苷酸同源性均为99.87%，氨基酸同源性为99.6%～99.8%。3株病毒与DENV-3核苷酸同源性为70.4%～70.6%。3株病毒编号分别为D1/TZ15/China/2016、D1/TZ16/China/2016、D1/TZ19/China/2016(Genbank ID: KY886977、KY886978、KY886979)。

2.4E基因BLAST及同源性分析通过BLAST与GenBank中已公布的E基因序列进行比对，3株病毒与湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、广州株(KR028435/G2/02/2014)均具有较高的一致性，核苷酸同源性分别为99.87%～100%、99.80%～99.93%。其中D1/TZ15/China/2 016株与湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)有相同的核苷酸序列。

注：●台州市本地感染病毒株；▲各亚型登革病毒代表株
图2 台州市I型登革病毒E基因系统进化树
Note: ●Indicates local infection virus strains; ▲Indicates representative Dengue virus strains
Fig.2 Phylogenetic analysis of E gene of dengue virus type I from Taizhou

2.5系统进化分析3株登革病毒E基因全长序列与GenBank查找24株DENV-I国内外流行株和参考株的E基因序列进行进化分析。根据Rico-Hesse 基因分型法，DENV-I型分为Genotype I～ Genotype V五个亚型[5]。用MEGA6.0相邻连接法(Neighbor-Joining Method)进行系统进化分析，结果显示这3株病毒在同一进化分支上，属于Genotype I，与湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、广州株(KR028435/G2/ZW-0802/2014)、广州株(KT428609/GZ/92/2014)亲缘关系较近，并与东南亚KJ806871/Malaysia/2014、KJ806872/Singapore/2014病毒株在同一进化分支上。

3 讨论

登革病毒是一种通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播的虫媒病毒，自然界存在4种血清型(DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ、DENV-Ⅲ、DENV-Ⅳ)，可引起登革热、登革出血热和登革休克综合症等急性传染病[6]。登革热已成为严重的全球性公共卫生问题，广泛流行于热带和亚热带的100 多个地区和国家。我国于1978—1990年在广东省、广西省等地发生过几次较大的登革热流行，2014年广东省暴发了自1986年以来最大的一次登革热疫情，共有44 894例患者，死亡6例[7-8]。2014年湖北也暴发了登革热输入病例。浙江省历史上共发生两起本地登革热疫情，于2004年在浙江慈溪市暴发I型登革热疫情，导致113例发病[9]；2009年义乌市暴发3型登革热疫情，导致180例发病[10]。2016年浙江省台州市暴发I型本地感染登革热疫情，导致3例发病。

本次研究的登革病毒进化分析显示，这3株病毒与湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、广州株(KR028435/GZ/02/2014)和广州株(KT428609/GZ/92/2014)亲缘关系较近。广州株(KR028435/GZ/02/2014)为2014年广东登革疫情暴发的代表株[8]，该株病毒主要来源于马来西亚、新加坡。湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)的传播来源于广东、东南亚，与广州株(KR028435/GZ/ 02/2014)在同一进化分支上。同时进化树也表明这3株病毒与东南亚病毒株KJ806871/Malaysia/2014、KJ806872/Sing-apore/2014也具有较高的一致性。台州市暴发的3例登革热病例两月内均没有外出旅行史，不属于首发病例，也不能确定属于几代病例。系统进化分析表明此次台州本地登革疫情暴发可能是首发病例去过广东或东南亚，回到台州未出现典型症状，未及时发现，经过多次传播，导致本地暴发流行。

目前我国尚未形成登革病毒地方流行区[9]，浙江省台州市地处亚热带，与广东、东南亚贸易频繁，蚊媒密度高，存在登革病毒传播和生长的条件，极易使输入传染病变成地方传染病，存在二代病例感染风险。台州往年以输入病例为主，是首次本地暴发流行。本次台州市本地暴发登革热疫情提示应加强登革热的防控意识，加强对登革热及其病毒检测；加强登革热相关专业知识的培训，提高医务人员的诊断能力。

利益冲突:无

参考文献

[1] Jiang LY，Jing QL，Liu Y，et al. Molecular characterization and genotype shift of dengue virus strains between 2001 and 2014 in Guangzhou[J]. Epidemiol Infect, 2017, 145(4): 760-765. DOI:10.1017/S0950268816002429.

[2] Guzman MG, Harris E. Dengue[J]. The Lancet, 2015, 385(9966):453-465.DOI:10.1016/ s0140-6736(14)60572-9.

[3] Hermann LL, Gupta SB, Manoff SB, et al. Advances in the understanding, management, and prevention of dengue[J]. J Clin Virol, 2015, 64:153-159. DOI:10.1016/j.jcv.2014.08. 031.

[4] 周经姣, 方周云, 晏辉钧, 等. 登革1型病毒广州分离株全长E基因序列测定与分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2007, 23(1)：48-52. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2007.01. 012.

[5] Goncalvez AP, Escalante AA, Pujol FH, et al.Diversity and evolution of the envelope gene of dengue virus type 1[J]. Virology, 2002, 303(1):110-119. DOI:10.1006/viro.2002. 1686.

[6] Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, et al. The global distribution and burden of dengue[J]. Nature, 2013, 496(7446):504-507. DOI:10.1038/nature 12060.

[7] 应若素, 王建, 洪文昕, 等. 广东省2014年登革热暴发流行的临床和实验室特点[J]. 中华传染病杂志, 2014 32(12):719-723. DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2014.12. 004.

[8] Wang P, Wang H, Yu J, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of dengue virus type 1 in Guangdong in 2014[J]. Springer open, 2016, 5(1):1942. DOI:10.1186/s40064-016-3604-4.

[9] 严菊英, 卢亦愚, 翁景清, 等. 浙江省登革热暴发疫情的病原学和分子生物学研究[J]. 病毒学报, 2006:22(25):339-344. DOI:10.3321/j.issn:1000-8721.2006.05. 003.

[10] 严菊英, 张严峻, 茅海燕, 等. 2009年浙江省义乌市登革热暴发疫情实验诊断和病原分子溯源[J]. 中华预防医学杂志, 2010:44(12):1091-1096. DOI:10.3760/cma.j.issn. 0253-9624.2010.12.007.