毕赤酵母基因工程菌发酵生产抗菌肽工艺分析

韦忠明

摘 要：当前，我国经常会出现滥用抗生素的现象，导致患者的生命安全受到极大威胁，诱发多种微生物菌株，且在发明新抗生素的时候，需耗费很长时间，无法满足当前的发展需求，因此，为了提升抗生素药物的安全性，下文针对毕赤酵母基因工程菌发酵生产中的抗菌肽工艺进行分析，以实验的方式表达，得出准确的结论，以供参考。

关键词：毕赤酵母基因工程；菌发酵生产；抗菌肽工艺

中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2018）07-0220-01

抗菌肽属于新型的抗菌药物，属于具有较大潜力的抗生素替代制剂，当前，我国已经研究出将近一千种抗菌肽，每种都具备特殊的抗菌机理，与抗生素相较，不容易产生耐药性，热稳定较高，因此，需合理使用抗菌肽，代替抗生素药物。

1 实验中的材料与方式

1.1 材料分析

本次实验之前构建了抗菌肽毕赤酵母基因工程菌LY，并使用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为实验材料。实验中选择的试剂为酵母粉、蛋白胨、天门冬氨酸、三氯乙酸、甲醇试剂、氯化钠试剂与葡萄糖试剂。

1.2 明确培养基的配方

在实验中，主要使用的为酵母种子与固体两种培养基类型。前者的配方为：酵母粉（1%）、蛋白胨（2%）、葡萄糖（3%），且pH值呈现自然的状态。后者培养基的配方为：酵母粉（0.6%）、蛋白胨（1.1%）、氯化钠（1.1%）、琼脂粉（2.1%），且pH值呈现自然的状态。

1.3 具体的实验方式分析

1.3.1 对菌株的重组进行诱导表达

可筛选阳性的酵母菌株，将其放置在YPD液体中实现一级培养，液体剂量为5ml，温度为30摄氏度，以每分钟200r的速度振荡，在等于2的时候，取出1ml培养液，在YPD中重新培养，继续振荡，24个小时之后加入浓度为1.1%的甲醇，并培养48个小时，然后以每分钟8000r的速度进行离心，时间为10分钟，针对表达上清液进行全面的收集，并取出的表达上清液，实现抑菌实验工作。在抑菌实验中，使用21%的三氯乙酸溶液针对上清液进行沉淀，然后加入4摄氏度左右的注射用水，以每分钟14000r的速度进行离心，时间为20分钟，针对沉淀物进行收集，然后放置在0.6ml的PBS溶液中进行处理，在电泳分析的情况下，明确三分子多肽的实际表达产物情况。

1.3.2 利用琼脂扩散方式针对抗菌肽的抑菌活性进行测定

筛选对数生长期中的大肠杆菌与金色葡萄球菌，并制作成为浮液，各自为15，将其与LB固体培养基均匀搅拌，固体培养基的温度为56摄氏度，剂量为31ml，然后平铺在平板中，在溶液凝固之后，在平板上面放置牛津杯，然后将已经保存的上清液放置在牛津杯中，剂量为100，在此期间，可以将平板设置在温度为37.5摄氏度的恒温培养箱中，待过夜之后，将其与体积相同且空载体转化的酵母上清液进行隐性对照，在第二天的时候，合理仔细观察抑菌圈，并记录大小数据，确保实验的准确性。

1.3.3 针对抗菌肽的表达培养基相关配方进行合理优化处理

本实验可以使用四个因素、三个水平进行正交实验，制定完善的设计方案，在正交试验的过程中，全面观察培养基中碳源对菌株相关抗菌肽表达方式的影响情况。如果酵母膏的浓度为1%、蛋白胨的浓度为2%，就可以针对谷氨酸与天冬氨酸的实际情况进行分析，了解其对于菌株抗菌肽实际表达的影响情况。

1.3.4 针对抗菌肽的实际表达条件进行合理的优化

在优化抗菌肽实际表达条件的时候，可以使用三种方式。其一，了解培养基的pH值，在充足抗菌肽方面的表达影响情况。其二，了解不同甲醇浓度的表达影响。其三，了解发酵时间的表达影响[1]。

2 实验结果

2.1 针对抗菌肽进行表达

在实验之后可以发现，通过空载体酵母与重组酵母的分析，可以得到上清液蛋白的具体结果，其中，重组酵母上清液中，主要蛋白质条带分子量在4.1kda左右，而对于空载体的酵母而言，在阴性对照期间，没有条带，因此，需合理使用实验方式。

2.2 不同碳源的实际影响情况

在酵母菌抗菌肽表达方面，不同碳源会对其造成不同的影响。在正交实验的过程中，空白R数据为0.07，而葡萄糖R数据为0.08，可以说明，葡萄糖碳源对于抗菌肽的表达情况所产生影响很小。对于甘油而言，R数据为0.56，属于几种碳源中，对抗菌肽表达情况影响最大的元素[2]。

2.3 谷氨酸与天冬氨酸的实际影响分析

使用正交实验方式，针对酵母粉与蛋白胨等进行研究，了解此类有机氮源在酵母抗菌肽表达方面的实际影响情况，可以发现，有机氮源对其产生的影响很小，且在实验中，可以尝试添加不同的氨基酸，利用氨基酸的表达方式，协调天冬氨酸表达，以此提高抗菌肽表达的灵活性。在实验中可以发现，0.26%谷氨酸制剂与0.6%天冬氨酸制剂会促进抗菌肽的表达，但是，继续增加浓度，不会产生明显的促进效果[3]。且在使用0.26%谷氨酸的时候，抑菌圈的直径可以达到1.9cm左右，而使用0.6%的天冬氨酸，抑菌圈的直径在1.75cm左右，且谷氨酸的价格很低，因此，在实际实验的过程中，可将谷氨酸作为主要的氮源，并将浓度控制为0.26%。

2.4 表达条件实际优化分析

在使用甲醇材料的时候，需在不同浓度、pH值与发酵时间的条件之下进行比较与研究，在实验的过程中可以发现，将酵母菌转结到培养基（pH5.5）中，将培养时间控制在24小时，之后添加1.5%的甲醇材料，在30摄氏度的空间中培养72小时，可得到最高的抗菌肽表达成效[4]。

2.5 优化之前与之后发酵液对抑菌活性的影响对比

在实验的过程中，需针对培养基的优化结果进行对比，可实现柠檬酸铵、蛋白胨与酵母膏之间的发酵，在了解发酵工艺条件的情况下，明确最终的结果。在实验中发现，使用革兰阳性的金色葡萄球菌进行实验，优化之后的抗菌肽效果比优化之前高出57%左右，且在实验中也可以发现，革兰阴性大肠杆菌会受到抗菌肽的抑制性影响，且优化之后比优化之前的效果高出63%左右。

通过本次实驗，可以了解到革兰阴性与阳性菌会受到抗菌肽的抑菌作用，属于广谱的抗菌肽，且在研究中表面，利用发酵培养基与相关工艺技术的优化方式，能够促进酵母菌株的抗菌肽表达，并形成良好的处理依据，可全面优化具体的实验模式[5]。

3 结语

当前，我国经常会出现滥用抗生素的现象，导致抗生素的使用效果降低，甚至诱导多种抗生素的抗性菌株增加，且我国在新型抗生素方面，开发与研究需要很长时间，耗费的成本也很高，无法与耐药性菌株的临床发展速度相较，导致人们的身体健康受到严重威胁，这也导致人们在安全驱使之下，迫切追求新型的抗菌制剂。而抗菌肽属于新型抗菌药物，可以成为抗生素的替代制剂，当前，我国已经得到了抗菌肽的研究成果，并在实际研究中，实现抗菌谱的优势，因此，在临床治疗发展中具备很高的发展前景。上述实验已经得出了准确的结论，可以形成借鉴性。

参考文献

[1]郝思怡.金环蛇抗菌肽Cath-BF在毕赤酵母中的组成型分泌表达[D].广东药学院，2015.

[2]王尔群.鸡AvBD6成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性分析[D].安徽农业大学，2016.

[3]魏海婷.AvBD2在毕赤酵母中的组成型表达及其发酵条件优化[D].安徽农业大学，2015.

[4]阮海宁.生物转化法生产谷胱甘肽的工艺研究[D].浙江大学，2014.

[5]郭晋霞.重组双碱基内肽酶在毕赤酵母中的表达制备及酶活鉴定[D].重庆理工大学，2016.