水稻“抗癌”新因子bsr-d1

李伟滔，朱紫薇，尹俊杰，贺闽，王静，朱孝波，陈学伟

四川农业大学水稻研究所，成都 611130

水稻是重要的粮食作物，世界约一半的人口以它为主食。然而，水稻第一大真菌病害——稻瘟病，被称为水稻“癌症”，严重危害水稻的产量和品质[1]。自20世纪60年代中期起，科学家便开始了鉴定和克隆水稻稻瘟病抗性相关基因的工作。目前鉴定到的稻瘟病抗性(resistance，R)基因中，已有28个被成功克隆。这些基因中，仅Pid2和Pi21属于非经典R基因[2-3]。R基因聚合是当前水稻抗病育种的主要技术手段，但费时费力，而在水稻抗病育种中能够直接被应用的广谱抗病基因资源匮乏，严重限制了抗病育种技术的发展及应用。本文介绍了如何挖掘水稻广谱抗稻瘟病遗传位点bsr-d1并解析其抗病机理，同时阐述了其潜在的育种应用价值。

1 挖掘广谱抗稻瘟病遗传位点bsr-d1

水稻“地谷”是福建省农业科学院在20世纪90年代初育成的水稻保持系，具有对稻瘟病的广谱持久高抗性[4]。尽管已从“地谷”中鉴定并克隆出两个抗病基因——Pid2和Pid3，但这两个基因均具有小种特异性抗性[2,5]。近期研究表明“地谷”的广谱持久抗性既不同于LysM结构域蛋白，如几丁质诱导物结合蛋白(CEBiP)等所介导的抗性，也不同于含有核苷酸结合位点和富含亮氨酸重复序列(NBS-LRR)的蛋白介导的抗性[4]。因此，“地谷”中可能存在其他新型因子来介导对稻瘟病的广谱持久抗性。

农作物如果携带了广谱抗病基因，则不会因为病原菌的变异而失去抗性，因此在田间表现出持久抗病性。然而，抗病基因常伴随着品质差或产量低的副作用，因此在育种中难以利用。采用常规的遗传定位的方法，获得的抗病相关基因通常具有小种特异性。如：前期从“地谷”中鉴定并克隆的Pid2和Pid3，均具有小种特异性抗性[2,5]。因此，很难用这种方法寻找到广谱抗病位点。我们研究团队针对水稻“地谷”的重测序数据，以及从国家作物基因资源库中随机筛选得到的66份非广谱抗病水稻材料的重测序数据，通过全基因组关联分析(GWAS)获得“地谷”的特异的单核苷酸多态性位点(singlenucleotide polymorphism，SNP)。然后，利用稻瘟病抗病材料“地谷”和易感稻瘟病材料“丽江新团黑谷”构建重组自交系群体(recombinant inbred line，RIL)。首先筛选“地谷”特异的SNP，并将分布在外显子内改变氨基酸变化或导致翻译提前终止的SNP，以及位于启动子1.5 kb内且位于转录因子结合的顺式作用元件的核心序列内的SNP作为候选分析有效的SNP。然后，利用构建的RIL群体，从中筛选到不含Pid2和Pid3，且表型与丽江新团黑谷相似的株系作为候选基因的筛选材料。将稻瘟病病区种植所选的RIL株系种植于大田自然发病区，进行抗性鉴定。然后，利用筛选到的SNP，开发衍生的酶切扩增多态性序列(dCAPS)标记。利用分子标记与RIL株系抗性结果的关联分析，明确了与稻瘟病广谱抗性相关联的关键位点SNP33，它位于MYB转录因子结合的顺式作用元件的核心序列内。我们将这个SNP33所在的基因命名为Bsr-d1，而“地谷”中对应的基因即为bsr-d1[6]。

2 Bsr-d1编码一个新的稻瘟病抗病相关的转录因子

为分析Bsr-d1的分子功能，我们分别构建了Bsr-d1的RNA干涉、CRISPR/Cas9基因敲除和过量表达的转基因水稻株系。通过稻瘟病接菌试验，发现Bsr-d1的RNA干涉和CRISPR/Cas9敲除株系均表现出稻瘟病抗性增强，并且这种抗性具有广谱性，而过量表达株系表现为抗性减弱[6]。因此，bsr-d1是调控稻瘟病广谱抗性的新的遗传位点。

Bsr-d1编码一个C2H2家族的转录因子，它对稻瘟病抗性起着负调控作用。在植物免疫信号传导中，转录因子精细调控下游靶基因是调控防御机制所必须的[7]。利用基因芯片(microarray)和转录组测序(RNA-seq)技术，已鉴定出大量受病原菌影响的转录因子[4,8]，这些参与植物抗病的转录因子主要分布在5个转录因子家族中——WRKY、APETALA2/乙烯应答因子(AP2/ERF)、碱性亮氨酸拉链(bZIP)、碱性螺旋-环-螺旋类转录因子(bHLH)和NAM/ATAF/CUC(NAC)[7]。此前，尚未报道C2H2类型转录因子对植物抗病的调控作用。

Bsr-d1属于调控稻瘟病抗性的一类新的非WRKY家族转录因子。目前，水稻中参与稻瘟病抗性的转录因子多属于WRKY家族[9]，而调控稻瘟病抗性的非WRKY转录因子还十分少见，仅有OsERF922和OsNAC111。OsERF922负调控水稻稻瘟病的抗性，其主要影响苯丙氨酸氨裂解酶基因和双萜类植物抗毒素合成相关基因的表达[10]；OsNAC111正调控水稻的稻瘟病抗性，这依赖于它对几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表达的激活作用[11]。Bsr-d1对稻瘟病抗性并不依赖于OsERF922和OsNAC111[6]。

与大多数水稻抗病基因编码受体蛋白不同，bsr-d1基因编码的是控制免疫反应强弱的调节蛋白。这可能是稻瘟病菌不能在携带该位点的“地谷”上产生强致病性的原因。

3 bsr-d1介导一种新型抗稻瘟病分子机制

活性氧(reactive oxygen species，ROS)爆发是植物细胞应对病原菌侵害的早期反应，它也是病原分子模式激发的免疫反应(PAMPs triggered immunity，PTI)中的一个重要现象[12]。植物细胞中，过氧化氢(H2O2)作为ROS的主要成分之一，它可通过增强植物细胞壁来阻挡病原菌的入侵[13]。H2O2还可介导植物防御反应的信号级联放大，从而产生抗病反应[14]。例如：H2O2能够激活抗病相关的MPK3/MPK6级联反应[15]，其中MPK3/MPK6能够磷酸化WRKY33和ERF6，从而调控抗病相关的乙烯、抗毒素和吲哚基硫苷的合成，进而影响植物抗病性[15]。

ROS的爆发是抗病反应的起始，增强ROS合成[13-14]或削弱ROS降解[16]，均可显著增强植物抗病性。当前研究多数集中于ROS的合成途径，而有关ROS降解途径的研究较少。番茄基因Cat1和Cat2参与降解H2O2，它们的表达受抑制后，番茄中H2O2积累量增加，PR1蛋白和水杨酸(salicylic acid，SA)含量升高，从而促进细胞坏死，增强对烟草花叶病毒的抗性[16]。本研究发现，bsrd1主要调控过氧化氢酶基因的表达，以此实现对ROS的调控(图1)：在bsr-d1或Bsr-d1敲除水稻中，过氧化氢降解酶基因表达降低，水稻中过氧化氢降解减弱，导致H2O2富集，使水稻抗病性明显提高[6]。bsr-d1的这种抗病调控机制，不同于以往报道的由H2O2合成相关基因OsRbohA、OsRbohB和OsRbohE介导的抗病机制[17]。

图1 bsr-d1介导水稻稻瘟病抗性的分子模型。稻瘟病菌侵染水稻后，能够诱导bsr-d1的上调表达，进而使过氧化氢酶上调表达，加速了H2O2的降解，从而减少了H2O2的积累，使水稻感病；而“地谷”中，等位基因bsr-d1由于其启动子位点由原来的A变成G，导致MYBS1强烈地结合bsr-d1启动子，抑制bsr-d1的上调表达，因此，过氧化氢酶并没有被诱导表达，使H2O2保持一定的积累量，以此增强了水稻的稻瘟病抗性

4 bsr-d1的育种应用潜力

垩白是衡量稻米品质的重要性状之一，直接影响稻米的外观品质、加工品质和商品流通[18]。非R基因中，pi21具有稻瘟病广谱抗性，但是它与控制垩白的基因LOC_Os04g32890紧密连锁[3]。水稻育种中，需打破pi21与LOC_Os04g32890的连锁，才能保证提高抗病性的同时不破坏水稻品质，这大大增加了育种难度，因此极大限制了pi21在生产上的实际应用。

水稻籽粒垩白相关的QTL主要位于水稻染色体1、2、4～12[19-20]，而3号染色体上未发现有控制垩白的QTL。Bsr-d1位于3号染色体前臂靠近着丝粒的位置(Chr3:18 436～18 437 kb)，该位点附近没有发现控制垩白及其相关的基因，故bsr-d1不同于pi21，无需分离与其紧密连锁的控制垩白的基因即可用于水稻抗性育种。敲除Bsr-d1后，水稻的稻瘟病抗性提高，而与水稻产量相关的农艺性状以及主要的品质性状——垩白率和垩白度，却未受到显著影响。这进一步表明含有与“地谷”位点一致的bsr-d1在育种中具有很大的应用潜力。

此外，生物信息学分析表明，目前已经测序的全球3 000份水稻资源中，仅约10%的水稻材料含有与“地谷”bsr-d1相同的等位位点(图1)[6]，表明bsr-d1具有广阔的育种应用前景。

5 总结与展望

控制植物病害的主要手段包括施用化学农药和种植抗病品种。大量施用化学农药虽能控制病害发生，但农药的使用不仅增加农民种植成本，还不可避免地会导致农药残留及破坏生态环境。作为防控植物病害最经济有效的手段，种植抗病品种可有效保证农业生产过程中的资源节约和环境保护，这对于生态文明建设具有十分重要的意义[21]。抗病基因，特别是广谱抗病基因的挖掘是培育抗病品种的重要基础。但目前对植物的广谱抗病基因还知之甚少，已报道的广谱抗病基因主要包括小麦的Yr36[22]和Lr34[23]，大麦的mlo[24]，拟南芥的RPW8[25]，水稻的STV11[26]、pi21[3]、Xa21[27]、Xa23[28]、Pi9[29]和Pigm[30]。

本文通过全基因组关联分析和遗传群体的结合利用，筛选和鉴定出“地谷”中的广谱抗病位点bsr-d1，为克隆控制目标性状的基因提供了新策略。Bsr-d1编码的蛋白能调节水稻对稻瘟病的免疫反应程度，以防止水稻因过度免疫造成自身伤害。稻瘟病菌中可能存在一个或一些未知的因子，通过诱导Bsr-d1高量表达，使过氧化氢酶过量表达，加速H2O2的降解，从而减少H2O2的积累，降低水稻对稻瘟病菌的抵抗能力。“地谷”中的bsr-d1基因通过自然变异，不再“听令”于稻瘟病菌，在受到稻瘟菌侵染时不会增加表达，使得稻瘟病菌的这一个秘密武器失去作用，从而摆脱稻瘟病菌的“控制”[31]。同时，“地谷”的bsr-d1具有对稻瘟病的广谱抗性，且对水稻的产量和品质性状无显著影响，为水稻的抗病育种工作提供了更有效的目标基因，在水稻抗病育种中具有很大的应用潜力。

(2017年9月6日收稿)■

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