苯并[b]荧蒽对大鼠肺泡巨噬细胞的氧化损伤效应

张丽凤,魏海英,张云芸

(山西大学 环境与资源学院,山西 太原 030006)

0 引言

多环芳烃(PAHs) 是一类在环境中广泛存在的有机污染物,主要由煤炭、石油、木材、塑料等高分子有机材料的不完全燃烧产生[1],是空气污染的重要污染源之一。在多项研究中发现,大气细颗粒物中PAHs的主要成分之一是苯并[b]荧蒽(Benzo[b]fluoranthene)[2-5]。苯并[b]荧蒽是具有5个苯环的典型PAHs化合物,致癌性极强[6],常常作为一种PAHs环境暴露指标[7]。

肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages,AM)是肺脏重要的功能细胞,是肺部的第一道功能屏障,对维持机体正常的生理活动有着重要作用[8-9]。大气中的颗粒物会到达肺泡被AM摄取[10],沉积在肺中的颗粒或颗粒上携带的可溶性毒物的相互作用,会导致炎症而损害AM吞噬活性[11-12]。

关于PM2.5对肺泡巨噬细胞的毒性作用课题组已经做了大量的研究,主要包括沙尘暴PM2.5、灰霾PM2.5对肺泡巨噬细胞的毒性作用以及毒理机制的研究等,结果表明PM2.5会对AM造成一定的氧化损伤,并使其细胞膜通透性增加,PM2.5还会造成AM线粒体融合分裂的异常[13-16]。已有研究结果多为PM2.5混合成分的毒性作用,而哪些成分起主要作用尚不清楚。课题组对太原市不同季节PM2.5化学成分分析发现,冬季和夏季PM2.5中苯并[b]荧蒽含量分别为16.3 ng·m-3 [17]和12.5 ng·m-3,为PM2.5中PAHs类最高,我们推测苯并[b]荧蒽对PM2.5毒性具有较大的贡献率,但具体机制尚不清楚。因此,本研究拟以苯并[b]荧蒽为研究对象,采用体外细胞培养及染毒方法对AM进行暴露,暴露后测定AM中的抗氧化酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽)活性以及脂质过氧化物丙二醛和活性氧含量变化,初步探讨苯并[b]荧蒽暴露对大鼠 AM 的氧化损伤作用,从而为PAHs毒性机理提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验试剂与仪器

实验试剂:RPMI-1640培养基,考马斯亮蓝 G-250、小牛血清、0.18%胰蛋白酶、牛血清蛋白(BSA)、四甲基偶氮唑盐(MTT),二甲基亚砜(DMSO)、ROS检测试剂盒、MDA 试剂盒、SOD 试剂盒、GSH 试剂盒,苯并[b]荧蒽母液(5 mg·mL-1甲醇)。

实验仪器:低温高速离心机、细胞恒温培养箱、TU-1810 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司)、Accuri C6流式细胞仪(BD,美国)、酶标仪、 HZQ-F100 振荡培养箱。

1.2 大鼠肺泡巨噬细胞的提取和培养

每次实验选取4只体重为220 g～250 g 的SPF 级雄性Wistar大鼠,每只腹腔注射1.0 mL的质量体积比为1%戊巴比妥钠进行全身麻醉,然后腹主动脉放血致死,打开大鼠胸腔,使用灭菌后的磷酸盐缓冲液 (PBS,pH=7.0)灌洗双肺,收集肺泡灌洗液(BLAF),将BLAF于4℃、3 000 r·min-1离心 10 min,弃上清液,用含质量体积比10% 小牛血清的 RPMI1640 培养液洗涤沉淀两次,制成细胞悬浮液,使用台盼蓝拒染法计数,然后进行稀释,将细胞稀释液(2×106～3×106个·mL-1)分装于细胞培养皿中,每皿3 mL,置于细胞培养箱中37℃、质量体积比5%CO2培养2 h后,除去原培养液,用PBS轻轻洗涤1～2次,去除非贴壁的细胞和原培养液成分,贴壁的肺泡巨噬细胞纯度大于95%[18],备用。

1.3 AM存活率的测定

采用MTT分析法测定AM存活率。将细胞悬液稀释为浓度1×105个·mL-1～2×105个·mL-1, 以每孔100 μL细胞悬液添加到96孔培养板中,贴壁2 h后,除去培养液,每孔添加不同浓度的(20 nmol·L-1、40 nmol·L-1、60 nmol·L-1、80 nmol·L-1、100 nmol·L-1)苯并[b]荧蒽,同时设置对照组,每个浓度组设6 个平行。24 h染毒后,除去染毒液,每孔加100 μL培养液和20 μL MTT(5 mg·mL-1) 继续在37℃细胞培养箱培养4 h,然后去上清液,将每孔添加150 μL DMSO,室温下振荡10 min,直至蓝紫色结晶全部溶解,将液体平行转移到另一96孔板中,用酶标仪上在490 nm波长处测 OD值,计算细胞的相对存活率。

1.4 生物学指标的测定

染毒24 h后,除去培养液,用PBS清洗后,胰蛋白酶消化收集细胞,进行生物学指标的测定。

蛋白含量测定:以牛血清白蛋白为标准溶液(1 mg·mL-1),作蛋白含量0 μg、10 μg、20 μg、30 μg、40 μg、50 μg、60 μg的标准曲线,采用考马斯亮蓝法,于 595 nm 波长下测其吸光值。

1.4.1 GSH、SOD及MDA的测定

SOD活性采用试剂盒测定,在酶标仪550 nm处测定其吸光值,每毫克蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达到50%时对应的SOD的量为一个SOD活力单位,总SOD活力(U·mg-1prot)表示细胞抗氧化能力。

GSH活性采用试剂盒测定,在412 nm处测定吸光值,以单位蛋白质中GSH的活性(nmol·mg-1prot)表示细胞的抗氧化能力。

MDA含量采用试剂盒测定,严格按照试剂盒步骤进行,其最大吸收波长在532 nm,以单位蛋白质中MDA的含量(nmol·mg-1prot)表示细胞脂质过氧化程度。

1.4.2 ROS的测定

AM细胞内的活性氧(ROS)水平采用DCFH-DA(二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯)测定。将AM贴壁2 h后转移至于2 mL EP管中,使用PBS清洗1次。将DCFH-DA用无血清培养液按照1∶2 500的比例稀释,将稀释的DCFH-DA工作液添加到EP管中,每管1 mL,于37℃培养箱孵育25 min后,以3 000 rmin-1离心10 min后,使用PBS清洗3次。添加不同浓度的苯并[b]荧蒽染毒液对细胞进行染毒24 h,并且提前30 min对阳性对照管添加Rosup刺激物,24 h后,打匀细胞,过滤(200目),用流式细胞仪检测ROS,检测的荧光强度可反映细胞内ROS水平。

1.5 统计方法

采用SPSS11.5软件对数据进行分析,用单因素方差分析检验组间的差异显著性(*P<0.05,**P<0.01),用 Origin 8.0 完成制图与分析,实验数据以平均值±标准误差(Mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 苯并[b]荧蒽的细胞毒性

如图1所示,随着苯并[b]荧蒽染毒浓度的增加,AM存活率呈下降趋势,相对于对照组,低浓度(20 nmol·L-1) 组细胞存活率虽有下降,但并不显著,当染毒浓度大于40 nmol·L-1时,细胞存活率显著降低(p<0.05,p<0.01),对较高浓度组(80 nmol·L-1、100 nmol·L-1) 而言,AM 存活率下降极显著,这表明苯并[b]荧蒽具有很强的细胞毒性。

2.2 不同浓度苯并[b]荧蒽对AM中SOD和GSH的影响

苯并[b]荧蒽暴露24 h后,AM细胞中SOD活性呈剂量依赖性显著降低(P<0.01)(图2A),高浓度组苯并[b]荧蒽对SOD活力表现出极强的抑制作用。如图2B所示,随着苯并[b]荧蒽浓度的增加,GSH的含量呈递减趋势,当染毒浓度大于40 nmol·L-1时,与对照相比,GSH含量显著(P<0.01)降低,但在染毒浓度为 20 nmol·L-1时,并无显著差异。

Fig.2 Effect of benzo[b]fluoranthene on the activity of SOD (A) and thecontent of GSH (B) in AM.(*P<0.05，**P<0.01，vs control，n=6)图2 苯并[b]荧蒽 对AM中SOD活力(A)和GSH含量(B)的影响 (与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，n=6)

2.3 不同浓度苯并[b]荧蒽对AM中MDA的影响

从图3可以看到,随着苯并[b]荧蒽浓度的升高,AM中MDA 的含量逐渐增高,染毒浓度较低时,苯并[b]荧蒽对MDA的作用并不显著,当苯并[b]荧蒽的浓度超过60 nmol·L-1时,MDA的含量显著上升,表明苯并[b]荧蒽引起了AM的脂质过氧化。

2.4 苯并[b]荧蒽诱导ROS的生成

经苯并[b]荧蒽染毒后的AM细胞中,ROS的含量随苯并[b]荧蒽的浓度的升高而增加(图4),当染毒浓度大于40 nmol·L-1时,ROS的含量极显著增加(P<0.01)。高浓度处理时,ROS的含量与对照相比差异极显著(P<0.01)。

Fig.3 Effects of benzo[b] fluoranthene on the content ofMDA in AM. (*P<0.05，**P<0.01 vs control，n=6)图3 苯并[b]荧蒽对AM中MDA含量的影响(与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01 n=6)

Fig.4 Effects of benzo[b]fluoranthene on ROS generationin AM.(*P<0.05,**P<0.01 vs control n=6)图4 苯并[b]荧蒽对AM中ROS的影响(与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，n=6)

3 分析讨论

PM2.5的毒性与其成分是密切相关的[19-20]。在对PM2.5样品的成分分析发现,有机物中苯并[b]荧蒽浓度是相对较高的,本研究以苯并[b]荧蒽为研究对象,探讨了其对巨噬细胞的氧化损伤作用,结果表明苯并[b]荧蒽具有显著的细胞毒性。

综上所述,苯并[b]荧蒽有很强的细胞毒性,浓度依赖性诱导肺泡巨噬细胞SOD活性和GSH含量降低以及ROS和MDA水平升高。苯并[b]荧蒽对AM毒性的可能机制是,苯并[b]荧蒽通过诱导肺泡巨噬细胞中ROS的形成,降低抗氧化防御系统的抗氧化功能,引起细胞脂质过氧化,从而使细胞受到损伤,当这种损伤超过细胞自复能力时引起细胞死亡。

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