白眉蝮蛇毒中出血毒素种类鉴定的简便方法

韦传宝，邓 辉

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.皖西学院 抗体制备及其质量检测中心，安徽 六安 237012)

白眉蝮蛇(Agkistrodonhalysussuriensis)分布于我国东北地区[1]，是我国特有剧毒蛇，与江浙蝮蛇亲缘关系较近，该蛇为血循环型毒蛇，含类凝血酶和出血毒素[2]。类凝血酶是一种蛋白水解酶，具有抗凝、溶栓、去纤、扩张血管和改善微循环等多种功效[3-5]。由它水解生成的纤维蛋白凝块，没有侧链交联而易被纤溶酶降解，不引起血栓，因此在临床上可用于防治血栓性疾病。从白眉蝮蛇毒中提取的类凝血酶由中国卫生部命名为降纤酶(Defibrase)，已应用于临床。目前对白眉蝮蛇毒研究较多的成分也是“类凝血酶”，但是对出血毒素的研究尚未见报道。

在研究蛇毒出血毒素时，最基本的问题是要搞清楚所研究的蛇毒中含有多少种出血毒素，本研究通过试用多种蛋白染色试剂盒，找到了一种对蛋白质能够染色又不影响蛋白质活性的染色试剂盒，因此能够快速、方便地鉴定白眉蝮蛇毒中出血毒素的种类在研究蛇毒出血毒素时，最基本的问题是要搞清楚所研究的蛇毒中含有多少种出血毒素，本研究通过试用多种蛋白染色试剂盒，找到了一种对蛋白质能够染色又不影响蛋白质活性的染色试剂盒，能够快速方便地鉴定白眉蝮蛇毒中出血毒素的种类。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白眉蝮蛇毒购自安徽省祁门县祁门蛇伤研究所；DEAE-纤维素购自Sigma公司；高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒(产品编号：C510041)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯；小鼠购自安徽医科大学，规格18～22克；蛋白质纯化系统、层析柜、酶标仪、电泳仪、电泳槽等。

1.2 实验方法

1.2.1 出血毒素的初步分离纯化

用DEAE-纤维素离子交换凝胶吸附白眉蝮蛇毒的酸性蛋白，收集、浓缩、透析和保存未被吸附的碱性蛋白。被吸附在DEAE-纤维素凝胶中的白眉蝮蛇毒酸性蛋白分别用含不同浓度NaCl 的Tris-HCl 缓冲液(0.05 M，pH7.4)分段洗脱，NaCl浓度分别为0.05 M、0.10 M、0.15 M、0.2 M和0.5 M。每种浓度NaCl洗脱的组份分别收集、浓缩、透析和保管。

1.2.2 出血活性的检测

传统的出血活性检测是用家兔皮内注射的方法，最小出血剂量为产生直径10 mm出血斑点的出血毒素量[6]。本研究用18～22 g小鼠用于检测出血活性。小鼠有出血敏感、试验方便、成本低的优点。采用1 mL的注射器，将待测样品总量控制在0.2 mL，如果少于0.2 mL用生理盐水补齐。将样品注射到小鼠腹部皮下，每只小鼠腹部注射4个点。1小时后处死小鼠并解剖，出血明显且出血点直径10 mm以上确定为有出血活性。对于每一种出血毒素，通过注射不同量的出血毒素确定最小出血剂量(MHD)。

1.2.3 制备电泳胶的配制与制备电泳进一步纯化出血毒素[7]

制备电泳凝胶与检测电泳凝胶区别在于前者浓缩胶里不插梳子，12% PAGE制备电泳凝胶的配制见表1。

表1 12% PAGE制备电泳凝胶配制表

将初步纯化的白眉蝮蛇出血毒素(0.1 M 浓度NaCl洗脱组份)配制成20 mg/mL浓度溶液，每个电泳槽加1.0 mL出血毒素溶液，电泳结束取下凝胶，放塑料盒中待染色。

1.2.4 染色与脱色[7]

电泳后的凝胶用高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒(产品编号：C510041)染色。该试剂盒由染色液A、染色液B和脱色液组成，染色液A主要成分为考马斯亮蓝R-250，染色液B含一种特殊物质，能够加强考马斯亮蓝R-250与凝胶中蛋白质的结合，但考马斯亮蓝R-250与聚丙烯酰胺凝胶的结合很弱。染色时按照说明书规定的比例混合物染色液A和染色液B，为了方便脱色，染色的时间从30分钟(说明书中要求时间)缩短到5分钟，染色后用蒸馏水进行脱色，中途换2～3次蒸馏水。试剂盒中的脱色液含蛋白质变性剂，脱色后出血毒素的出血活性消失，水脱色使出血毒素的出血活性保留。

1.2.5 出血毒素种类的鉴定

经过蒸馏水多次脱色后，凝胶上蛋白质条带十分清楚，而且出血毒素蛋白条带中的出血毒素仍然具有出血活性。对每一个蛋白条带，用手术刀切下约2.5厘米长度的凝胶条带。加0.25 mL的生理盐水于研钵中将凝胶磨细，将样品注射到小鼠(重18～22克)腹部皮下，1小时后处死小鼠并解剖，观察注射部位是否有出血点，出血点对应的蛋白条带为出血毒素，出血点的数量即是出血毒素的种类。

2 结果

2.1 白眉蝮蛇出血毒素初步分离结果

被吸附在DEAE-纤维素凝胶中的白眉蝮蛇毒酸性蛋白分别用含不同浓度NaCl 的Tris-HCl 缓冲液(0.05 M，pH7.4)分段洗脱，NaCl浓度分别为0.05 M、0.10 M、0.15 M、0.2 M和0.5 M。经出血活性测定，浓度为0.10 M NaCL洗脱的组份含出血活性，其他洗脱组份(包括碱性蛋白组份)没有出血活性，说明白眉蝮蛇出血毒素能够被含0.1 M NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH7.4, 0.05 M)洗脱下来。

2.2 12% PAGE制备电泳结果

12% PAGE制备电泳进一步纯化白眉蝮蛇出血毒素的结果见图1。0.1 M NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH7.4, 0.05 M)洗脱组份在12% PAGE制备电泳凝胶上出现6条比较清楚的蛋白条带，分离效果很好。

图1 12% PAGE制备电泳进一步纯化白眉蝮蛇出血毒素电泳图

2.3 出血毒素种类鉴定结果

出血毒素种类鉴定结果见图2。蛋白条带1磨细后注射到小鼠皮下出现出血点，其他未出现出血点，说明蛋白条带1是一种出血毒素。

图2 蛋白条带1磨细后注射到小鼠皮下出现的出血点

3 讨论

在研究蛇毒出血毒素过程中，知道某种蛇毒含几种出血毒素是最基本的要求。过去解决这个问题的方法是分别分离各种出血毒素，故需要进行大量的分离工作，耗费了大量的人力和财力[8]。本研究的成功很好地解决了这个问题。

本研究的一个关键点是找到了一种蛋白染色试剂盒，是生工生物工程(上海)股份有限公司生产的高灵敏快速考马斯亮蓝染色试剂盒(产品编号：C510041)，该试剂盒的染色剂能够使蛋白质着色但不会使蛋白质变性，这与大部分蛋白质染色剂不同。该试剂盒由染色液A、染色液B和脱色液组成，染色液A主要成分为考马斯亮蓝R-250，染色液B含一种特殊物质，能够加强考马斯亮蓝R-250与凝胶中蛋白质的结合，但考马斯亮蓝R-250与聚丙烯酰胺凝胶的结合很弱。使用时染色液A和染色液B按照比例混合，染色时考马斯亮蓝R-250快速与凝胶中的蛋白质结合，几乎不与聚丙烯酰胺凝胶结合。为了便于脱色，染色时间降低到了5分钟。染色后不用试剂盒中的脱色液脱色，因为脱色液中含蛋白质变性剂，脱色后出血毒素的出血活性消失，我们改用蒸馏水脱色，而水脱色使出血毒素的出血活性保留。

本研究的另一个关键点是用12% PAGE制备电泳进一步纯化白眉蝮蛇出血毒素组份。与离子交换层析和分子筛层析的方法比，电泳方法分离效果更好，且更简单方便[9,10]。从电泳结果图可以看出，12% PAGE制备电泳能够将粗的出血毒素组份分离成了6条蛋白质条带，分离效果是离子交换层析和分子筛层析无法达到的。

从本研究的结果看，白眉蝮蛇毒含有1种酸性出血毒素，碱性组份中没有出血毒素，这是前人没有研究过的，至于出血毒素的性质则是本课题组下一步要详细研究的内容。

参考文献：

[1]韦传宝，徐建芬.白眉蝮蛇(Agkistrodonhalysussuriensis)蛇毒精氨酸酯酶对小鼠的生殖毒性及F1子代的影响[J].应用与环境生物学报，2004，10(5)：623-625.

[2]管立丰，戚正武．蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究[J]．生物化学与生物物理学报，1982，14(4)：303-313.

[3]RAWLINGS ND, BARRETT AJ. Evolutionary Families of Metallopeptidases[J].Methods Enzymol, 1995, 23(2):248:183-228.

[4]TAKEYA H，ODA K，MIYATA T. The Complete Amino Acid Sequence of the High Molecular Mass Hemorrhagic Protein HRlB Isolated from the Venom of Trimeresurus Flavoviridis[J].J Biol Chem，1990, 18(3):16068-16073.

[5]HITE LA, JIA LJ, BJARNASON JB. cDNA Sequences for Four Snake Venom Metalloproteinases: Structure, Classification, and Their Relationship to Mammalian Reproductive Proteins[J]. Arch Biochem Biophys, 1994, 56(3):308:182-191.

[6]KONDO H, KONDO S, I, kEZAWA H, et al. Studies on the Quantitative Method for Determination of Hemorrhagic Activity of Habu Snake Venom[J]. Japan J med Sci Biol., 1960, 19(4): 43-51.

[7]韦传宝，曹佳敏.在制备尖吻蝮蛇毒出血素抗血清中不同凝胶染色方法的比较[J].中国免疫学杂志，2016，32(12)：1793-1796.

[8]WEI CB, CHEN J. LI JH. Acutolysin C, a Weak Hemorrhagic Toxin from the Venom of Agkistrodon Acutus with Leucoagglutination Activity[J]. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis., 2011，17(1):34-41.

[9]韦传宝，李更青，梅元元，等.Studies on the Mutagenesis of α-neurotoxin from Naja Naja Atra Venom[J].中国新药与临床杂志，2015，34(10)：764-768.

[10]韦传宝，汪权，胡苇，等.尖吻蝮蛇出血毒素Ⅲ分离、抗血清制备、与其它出血毒素血清学关系[J].皖西学院学报，2015，30(2)：95-97.

Abstract: Crude hemorrhagins inAgkistrodonhalysussuriensisvenom were purified through DEAE-cellulose ion exchange chromatography. Acidic proteins inAgkistrodonhalysussuriensisvenom were absorbed by DEAE-cellulose and basic protein flowed out. Basic protein solution was collected, concentrated and dialyzed. Acidic proteins absorbed in DEAE-cellulose were eluted by Tris-HCl buffer (pH7.4) contained 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M and 0.5M NaCl step by step. Each component was collected, concentrated, dialyzed and preserved respectively. Hemorrhagic activity for each component was tested and the part with hemorrhagic activity was crude hemorrhagin component. The hemorrhagin in crude hemorrhagin component was purified further through 12% PAGE Preparation electrophoresis. The polyacrylamide gel was dyed using a kit named highly sensitive and rapid Coomassie brilliant blue staining kit (product No. C510041). Dyeing procedures were modified. The gel containing venom proteins was taken out and ground into gel suspension. The gel suspension was injected into mouse abdomen by subcutaneous injection. 1 hour later, the mouse was killed and the numbers of bleeding points was counted. Each bleeding point represents a kind of hemorrhagin. The results indicated that the part eluted by 0.1M NaCl possessed hemorrhagic activity. In this part, there are 2 kinds of hemorrhagins.

Keywords:Agkistrodonhalysussuriensis; hemorrhagin identification; reagent kit