河南华溪蟹2种C型凝集素原核表达及多克隆抗体的制备

赵芳芳，王 兰

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

河南华溪蟹（Sinopotamon honanense）为十足类甲壳类动物，仅有先天性免疫，对环境敏感性高，是研究先天性免疫的理想物种。模式识别受体（PRRs）对病原物质的识别是先天性免疫系统激活的第一步[1]。C型凝集素是一类重要的模式识别受体[2-3]，可通过其特有的C型凝集素样结构域（CTLD）结合病原体表面的糖类物质，从而实现对病原体的识别[4-5]。C型凝集素在先天性免疫中发挥重要作用。有关虾蟹类C型凝集素研究表明，虾蟹类C型凝集素具有促进吞噬、凝集、血细胞封装及抗病菌等免疫功能[6-8]。

山西大学生命科学学院王兰课题组致力于河南华溪蟹的镉毒性研究。镉是存在于环境中具有蓄积性的有毒物质[9-11]，对动物骨骼、肾脏、肝脏、肺脏、胃肠、心血管、生殖系统、神经系统及免疫系统具有毒性作用，并可致癌[12]。镉对河南花溪蟹具有毒性作用，并影响免疫相关酶活性[13]。另外，马文丽等[14]研究表明，镉能诱导河南华溪蟹金属硫蛋白的高效表达，何永吉等[15]曾就河南华溪蟹金属硫蛋白进行重组融合蛋白的原核表达，并制备了兔源多克隆抗体。ShLec21与ShLec23是通过前期工作筛选并鉴定的对镉敏感的2个基因。

本研究采用原核表达系统对ShLec21与ShLec23进行重组蛋白的融合表达，并制备兔源多克隆抗体，旨在为深入研究ShLec21和ShLec23基因在河南华溪蟹先天性免疫中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

日本大耳兔购自太原科鑫畜牧养殖场；pGEX-4T-1为山西大学生命科学学院动物毒理实验室保存；T-Vector pMD19（Simple）购于宝日医学生物技术有限公司（北京）；克隆宿主Trans5α、表达宿主Trans BL21（DE3）pLysS购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

核酸分子量标准、T4 DNA连接酶，宝日医学生物技术有限公司（北京）；限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ，NEB 有限公司（北京）；GST·BindTM，默克公司（MERCK）；彩色预染蛋白分子量标准、质粒DNA小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、EL-TMB显色试剂盒、96孔板，生工生物工程股份有限公司（上海）；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，Sigma公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、羊抗兔IgG-HRP，碧云天生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 ShLec21 与 ShLec23 原核表达载体的构建与鉴定 根据前期通过RACE技术获得的河南华溪蟹ShLec21与ShLec23基因全长，于2种C型凝集素基因5′UTR处分别设计ShLec21上游引物F1（5′-TGTGGGAGTGTCAACA GCACAGA）和 ShLec23上游引物 F2（5′-AGCACGAGACAAAGCAAAATCAT）；于 2种 C型凝集素基因 3′UTR处分别设计ShLec21 下游引物 R1（3′-ACACAATTTCGAGTCTC CGGGGT）和 ShLec23 下游引物 R2（3′-TGCTTTCA CTCATAACATCATGCT）。经PCR获得ShLec21与ShLec23部分基因序列（含部分5′UTR序列、3′UTR序列及完整ORF编码序列）连接于pMD19-Tsimple质粒，构建重组的克隆载体pMD19-T-simple-ShLec21与pMD19-T-simple-ShLec23。随后转入Trans5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。

分别在ShLec21与ShLec23开放阅读框序列（去信号肽）5'端设计 ShLec21引物 F3（5′-CGCGG ATCCGCA TGCAATCCCGGCTTCAA）与 ShLec23引物 F4（5′-CGCGGATCCCAGACC GTAACCCCGTCT G），引入酶切位点BamHⅠ；在3′分别设计ShLec21引物 R3（3′-CCGCTCGA GTTAAAACGTCTGACAGA TGGCA）与 ShLec23 引物 R4（3′-CCGCTCGAGATT ACAACTGACAAATTGGGTAAAAG），引入酶切位点XhoⅠ。以测序正确的pMD19-T-ShLec21与pMD19-T-ShLec23为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳并回收。将回收目的片段与pGEX-4T-1经BamHⅠ与XhoⅠ双酶切回收后进行连接。连接产物转入Trans5α感受态细胞中，经酶切验证筛选阳性克隆进行测序。

1.3.2 诱导 ShLec21-GST与 ShLec23-GST的原核表达 将重组载体pGEX-4T-1-ShLec21与pGEX-4T-1-ShLec23与空载体分别转入BL21（DE3）pLys表达宿主，涂于含有氨苄青霉素与氯霉素的抗性平板，挑取单克隆于5 mL LB培养液，200 r/min，37℃振荡培养至 OD600为 0.6～0.8时，加入 IPTG至终浓度为 0.2 mmol/L，150 r/min，28 ℃诱导表达 10 h，离心收集菌体。菌体经超声裂解之后，12 000 r/min收集上清与沉淀。同时以诱导前菌液超声破碎离心所得上清沉淀为对照，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色，鉴定蛋白表达情况。

1.3.3 包涵体融合蛋白复性纯化及多克隆抗体制备 选取能够高表达融合蛋白的菌株扩大培养于250 mL LB 液体培养基，OD600达 0.6～0.8 时，离心收集菌体，经超声破碎离心收集沉淀即为包涵体。包涵体经包涵体洗涤液（1%TritonX-100，5 mmol/L DTT，50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl） 洗 2 次（30 min/次），4℃离心弃上清保留沉淀。包涵体溶解液 10 mL （Tris-HCl 50 mmol/L，DTT20 mmol/L，尿素8 mol/L）重悬沉淀，4℃静置过夜溶解包涵体蛋白。12 000 r/min，4℃离心取上清，在梯度尿素（6，4，3，2，1，0 mol/L）中进行复性，每梯度浓度尿素中复性4 h。包涵体溶解蛋白复性结束后，利用GST-bind结合树脂进行纯化，Bradford法测定蛋白浓度。

将上述纯化的重组ShLec21-GST与ShLec23-GST融合蛋白，分别按照 200 μg（1 mL）与 1 mL 弗氏完全佐剂混合乳化，乳化液对雌雄2只日本大耳兔于背部皮下多点注射进行基础免疫。基础免疫14 d 后，用上述蛋白 200 μg（1 mL）与 1 mL 弗氏不完全佐剂乳化，对雌雄2只日本大耳兔进行首次加强免疫，加强免疫共3次，加强免疫之间间隔为7 d。最后一次加强免疫3 d后颈动脉采血并分离抗血清，-80℃保存。基础免疫前，经耳缘静脉采血分离阴性血清，作为对照。

1.3.4 抗 ShLec21-GST与 ShLec23-GST多克隆抗体效价测定 用间接ELISA法测定抗ShLec21-GST与 ShLec23-GST融合蛋白效价。以 1 μg/mL（100 μL/孔）包被酶标板，4℃孵育过夜。经洗涤、封闭、再洗涤后，加入100 μL倍比稀释融合蛋白抗血清为一抗，37℃孵育1 h。再次洗涤，然后以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG（HRP-IgG）为二抗（100 μL/孔），37℃孵育1 h。经显色终止，根据OD450判定结果。免疫前血清倍比稀释代替一抗作为阴性参照。判定方法：当 P/N＞2.1 为阳性，以 P/N＞2.1 所对应的抗体最高稀释倍数作为该抗体的效价（其中，P，N分别为阳性血清与阴性血清的OD450值）。

2 结果与分析

2.1 河南华溪蟹 ShLec21与ShLec23原核重组表达载体的构建

以河南华溪蟹肝胰腺组织cDNA为模板进行PCR扩增，在ShLec21预期大小555 bp及ShLec23预期大小597 bp附近分别得到单一目的条带（图1-A，B）。将得到的2个基因序列片段与pMD19-T-simple连接，成功构建重组克隆载体pMD19-T-simple-ShLec21与 pMD19-T-simple-ShLec23。

利用含酶切位点的引物，以pMD19-T-simple-ShLec21与pMD19-T-simple-ShLec23为模板进行PCR扩增，得到与ShLec21预期大小420 bp一致的目的条带（图2-A）及与ShLec23预期大小460 bp一致的目的条带（图2-B）。将得到的2个基因序列片段与pGEX-4T-1经BamHⅠ，XhoⅠ双酶切后连接，成功构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-ShLec21与pGEX-4T-1-ShLec23。重组 表 达 载 体 pGEX-4T-1-ShLec21，pGEX-4T-1-ShLec23经双酶切，分别在预期大小420，460 bp目的片段附近得到一单一条带（图3）。

2.2 ShLec21-GST与 ShLec23-GST重组融合蛋白的表达与纯化

IPTG诱导含重组表达载体pGEX-4T-1-ShLec21与pGEX-4T-1-ShLec23的表达宿主原核表达2个C-型凝集融合蛋白。表达菌超声破碎后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别在沉淀中约41 ku与42 ku目的条带大小处目的蛋白被诱导，包涵体蛋白复性纯化，得到ShLec21-GST，ShLec23-GST重组融合蛋白（图 4）。

2.3 ShLec21-GST与 ShLec23-GST多克隆抗体效价检测

经间接ELISA法测定2个C型凝集素抗体效价可知，雌兔抗ShLec21-GST血清效价可达1∶512 000，雄兔抗ShLec21-GST血清中效价可达1∶256 000；雌雄兔ShLec23-GST血清中效价均可达1∶128 000（图 5）。

3 讨论

在本研究中，分别将ShLec21与ShLec23基因cDNA部分编码序列插入pGEX-4T-1构建重组表达载体，利用原核表达系统表达GST标签融合蛋白。pGEX-4T-1是一种用于蛋白原核表达的载体[16-17]，大小仅为4 850 bp，全序列中含有tac启动子、谷胱氨肽转移酶GST标签序列。融合标签的使用利于蛋白的表达和纯化，同时可为目的蛋白的结构和功能研究提供便利手段[18-20]。GST融合表达体系具有增加外源蛋白的可溶性；可在不同的宿主中表达，适用范围广；可用不同的蛋白酶方便去除；特异性高、纯化方便且温和，提高外源蛋白稳定性以及很好保留蛋白的抗原性和生物活性，有利于抗体制备等优点[20-22]。正是基于GST标签的以上优点，本研究选择GST融合标签构建重组表达载体，表达融合蛋白，制备多克隆抗体。但是，GST标签也有缺点，比如重组融合蛋白不可溶，很难用变性的方法纯化。

ShLec21-GST和ShLec23-GST这2种重组融合蛋白是以不可溶的包涵体形式表达的。包涵体密度高，具有易于分离纯化的优点，但不具有生物活性[23]。造成包涵体蛋白表达的原因很多。首先，蛋白质表达量过高、合成速度快容易形成包涵体；第二，与重组蛋白的氨基酸组成有关，含硫氨基酸越多越容易形成包涵体，ShLec21-GST和ShLec23-GST这2个重组融合蛋白氨基酸序列中多处出现半胱氨酸，且经预测可形成1～2个二硫键，这可能是造成ShLec21-GST和ShLec23-GST形成包涵体蛋白的重要因素；第三，原核表达系统中缺乏所需要的酶和辅助因子；另外，温度、pH值以及培养基条件也是影响包涵体形成的因素[24-26]。本研究通过对河南华溪蟹2种C型凝集素包涵体蛋白进行复性纯化，并免疫日本大耳兔，制备了兔源抗血清。该抗血清的获得可为进一步研究ShLec21与ShLec23在河南华溪蟹先天性免疫中的功能打下基础。

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