hMTERF3基因在卵巢癌组织的表达及其对预后的影响＊

熊 伟，杨勇琴，李 彬，梅 雯，严长宝，戴莉萍，余 敏

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而居第三位，但卵巢癌病死率居各类妇科恶性肿瘤的首位，5年生存率不足30%，严重威胁女性健康和生命［1］。卵巢癌早期症状隐匿，常在症状出现之前已经出现转移，大多数患者就诊时已处于晚期［1］。卵巢癌的临床治疗以手术为主，化疗为辅，并配合放疗、生物学治疗等手段［2］。近年来，随着医学分子生物学理论和技术的发展，卵巢癌的基因治疗成为大家关注的焦点，并在临床上取得了较好的疗效，具有较好的应用前景。

人线粒体转录终止因子3（human mitochondrial transcription termination factor 3，hMTERF3），也称为线粒体转录终止因子结构域1（human mitochondrial transcription termination factor domain containing 1，hMTERFD1），是由417个氨基酸残基组成的蛋白质［3］。在人、大鼠、小鼠等7个不同的物种中进行氨基酸序列分析发现，该蛋白质包含5个保守的MTERF基序，含有3个亮氨酸拉链结构，是MTERF蛋白家族进化最保守的成员［4］。动物实验表明，敲除MTERF3基因的小鼠线粒体DNA拷贝数上升，MTERF3通过结合线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）启动子区而抑制线粒体基因表达过程，缺失MTERF3的细胞线粒体DNA两条链的转录起始活性均有增加，证明核基因编码的MTERF3是一种转录负性调控因子［5］。 Park 等［5］研究表明，哺乳动物MTERF3显著抑制mtDNA的表达，通过减少呼吸链复合体蛋白亚基的产生而降低氧化磷酸化水平，从而减少细胞内 ATP 的合成［5，6］。但目前为止，关于hMTERF3在卵巢癌中研究的尚未见报道。

利用基因芯片或者转录组分析为代表的高通量测序技术目前已经成为恶性肿瘤研究的强大工具，然而由于测序平台、样本数量以及分析方法的不同，常导致实验结果有偏差，结果分析比较片面。如何有效利用上述资源是当前科研人员面临的重大问题。数据挖掘及整合分析可以联合运用多种数据消除以上因素的影响，从整体的角度来理解这些数据。目前，生物数据整合分析逐渐成为大数据挖掘的重要方向，并已经广泛应用于多种类型的恶性肿瘤分析中。

Oncomine数据库是大型的肿瘤基因芯片整合数据库，最新数据涵盖已知所有的癌症类型，包含715个数据集，共计86 733个癌组织及正常组织数据。利用Oncomine可以进行肿瘤组织及其相应的正常组织中的mRNA表达差异分析，可以寻找潜在感兴趣的基因，其整合的大量数据保证分析结果具有极其重要的参考价值，也可以发现潜在的肿瘤生物标志物和肿瘤基因治疗靶点。该研究拟通过对Oncomine基因芯片和临床实验检测数据的整合分析，比较分析hMTERF3基因在正常卵巢上皮组织与卵巢癌组织中表达水平，并探讨其表达水平与卵巢癌患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 从Oncomine数据库中挖掘数据Oncomine v4.5数据库是一个基于基因芯片研究的数据库和整合数据挖掘平台，在此数据库中可根据研究的需要进行数据筛选和挖掘的条件设定。该研究中，笔者设定的数据筛选条件为：（1）“Gene：MTERFD1”；（2） “Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”；（3）“Cancer Type：Ovarian Cancer”；（4）“Date Type：mRNA”；（5）“Simple Type：Clinical Specimen”；（6）临界值设定条件 （P value＜1×10-4，fold change=2，gene rank=top 10%）。数据输出另存为Excel表格。

1.2 Western blot检测hMTERF3蛋白在卵巢癌和正常卵巢上皮组织中的表达选取2016年—2017年大理白族自治州第一人民医院病理科收集的30例卵巢癌组织及其对应的正常卵巢上皮组织，提取30对配对卵巢癌和正常卵巢上皮组织总蛋白，采用BCA法测定各组样本蛋白质的浓度。各取50 μg蛋白质上样，用SDS-PAGE凝胶电泳仪系统电泳分离总蛋白质，采用Trans-BlotTurboTM将蛋白质半干转印（15 V，7 min）至PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST封闭2 h，加入兔抗人MTERFD1多克隆抗体 （1∶1000稀释）4℃冰箱内孵育过夜，同时检测GAPDH蛋白的表达水平作为内参照；TBST液洗涤3次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗 （1∶5000稀释）4℃孵育2 h，TBST洗涤3次，5 min/次。将超敏型ECL显影液滴于PVDF膜条上，用ChemiDocTMXRS+超灵敏化学发光成像系统显色曝光，扫描成图像。蛋白质条带用Image LabTM5.2.1软件进行灰度值的计算，以MTERF3/GAPDH的比值表示MTERF3蛋白的相对表达水平，实验至少重复3次。

1.3 Kaplan-Meier Plotter进行患者生存周期分析利用 Kaplan-Meier Plotter数据库（http：//kmplot.com/analysis/）的卵巢癌数据集对hMTERFD1进行分析，得到相应的Kaplan-Meier生存曲线、风险比（Hazard ratio，HR）及 Log rank P（P value）值。探针选择为 JetSet，所需的有效Affymetrix ID：219363_s_at（MTERFD1）。首先根据人MTERFD1 mRNA表达水平分为高表达组和低表达组，截尾数据为肿瘤无进展生存期 （progression free survival，PFS）。符合条件的总病例数为1436例，分析人MTERFD1表达水平与卵巢癌患者预后的关系。然后，设定截尾数据为总体生存期 （overall survival，OS），符合条件总病例数为1657例，分析人MTERFD1表达水平与卵巢癌患者预后的关系。筛选条件如下：（1）“Cancer type：Ovarian Cancer”；（2）“Gene：MTERFD1”；（3）“Survival：OS or PFS”。

1.4 hMTERF3在不同分期卵巢癌中的预后作用

分别设截尾数据为PFS和OS，然后探针选择为JetSet， 所 需 的 有 效 Affymetrix ID：219363_s_at（MTERFD1），在Stage选项下面分别选择1期、1+2期、2期、2+3期、2+3+4期、3期、3+4期、4期， 分别在线分析人MTERFD1在不同肿瘤分期的卵巢癌患者中的预后作用。

1.5 统计学分析正常对照组和卵巢癌患者病例组之间hMTERF3表达的差异采用t检验。所用统计学分析采用SPSS 21.0软件进行，以双侧P＜0.05为有统计学显著性差异。

2 结果

2.1 hMTERF3在所有肿瘤类型中的表达Oncomine v4.5数据库中共收集了756个不同类型的研究结果，其中关于hMTERF3表达有统计学差异的研究结果共104个，hMTERF3表达增高的研究有76个，hMTERF3表达降低的研究有28个 （表1）。在妇科常见的恶性肿瘤中，乳腺癌中高表达的研究有12个，低表达的有5个；子宫颈癌中高表达的研究有2个，低表达的研究有0个；卵巢癌中高表达的研究有1个，低表达的研究有2个。

2.2 hMTERF3在卵巢癌中的表达在Oncomine v4.5数据库中，从2004年开始至今，共有11项研究涉及hMTERF3在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达，共包括995个样本（图1）。文章分别发表 于 Cancer Research［7，8］、Clinic Cancer Research［9］及 Cancer Science［10］。 荟萃 11 个研究结果发现，与对照组相比，hMTERF3在卵巢癌中高表达，其中位数值为3781.0，P=0.020，表明其高表达具有显著性差异。

表1 hMTERF3在Oncomine数据库中所有人类肿瘤相关研究中的表达

图1 Oncomine数据库中hMTERF3基因在卵巢癌中的表达

2.3 在不同研究中卵巢癌组织与正常卵巢组织hMTERF3的表达差异在Oncomine数据库中，笔者获取4个不同研究的基因芯片数据，作箱图比较分析，在所有研究的结果中，与正常卵巢组织相比，hMTERF3 mRNA在卵巢癌中的表达量均显著增高（P＜0.05）（图 2）。

2.4 卵巢癌组织与正常卵巢上皮组织hMTERF3蛋白的表达通过Western blot检测30例配对卵巢癌与正常卵巢上皮组织中hMTERF3蛋白的表达水平，结果显示，28例 （93.33%）卵巢癌组织中hMTERF3蛋白表达水平较正常卵巢上皮组织显著增高 （P＜0.05），而在2例卵巢癌组织中hMTERF3蛋白表达水平增高不显著（P＞0.05）（图 3）。

2.5 hMTERF3表达量与卵巢癌预后的关系为进一步明确hMTERF3基因表达量与卵巢癌患者预后的关系，通过Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存分析、风险比和Log-Rank检验。当截尾数据设置为卵巢癌患者PFS，经Kaplan-Meier Plotter数据库在线分析，HR=1.21，log-rank P 值为0.0027。当截尾数据设置为卵巢癌患者OS，Kaplan-Meier Plotter数据库在线分析，得到了相似的结果，HR=1.22，log-rank P值为0.0028。以上结果提示，hMTERF3 mRNA的表达水平是卵巢癌患者预后的危险因素（HR＞1），其表达水平越高，患者的预后越差（图 4）。

2.6 各个分期卵巢癌患者的预后与hMTERF3 mRNA水平的关系截尾数据为PFS时，早期卵巢癌患者（1期、1+2期或2期）中hMTERF3表达水平越高，患者预后越差（HR＞1）。其中在1+2期卵巢癌患者中HR值为2.43，表明越早期的卵巢癌患者，hMTERF3表达水平的预后价值越大。将截尾数据设置为OS，得出了相似的结果（表2）。认为早期卵巢癌患者中hMTERF3 mRNA水平越高，患者预后的越差。

图2 Oncomine数据库中hMTERF3基因在不同卵巢癌研究芯片中的表达

图3 卵巢癌与其相应的正常卵巢上皮组织的hMTERF3蛋白的表达（＊P＜0.05）

图4 hMTERF3表达量与卵巢癌患者预后的关系

3 讨论

卵巢癌发病的病因目前并不明确，可能与外部因素（包括物理、化学、生物致癌因子）和内部因素（包括免疫功能、内分泌、遗传、精神等因素），以及饮食营养失调和不良生活习惯等相关［11-13］。MTERF3是MTERF蛋白家族进化最保守的成员，基因敲除MTERF3的纯合子小鼠将导致胚胎发育异常和死亡［14，15］。体外凝胶迁移实验（EMSA）和体内染色质免疫共沉淀实验 （ChIP）证实，哺乳动物MTERF3能与线粒体重链转录起始位点结合，缺失MTERF3将导致线粒体DNA转录起始水平的增加，则进一步证实哺乳动物MTERF3是一种线粒体基因转录的负调控因子［5］。Wrdenberg等报道，MTERF3蛋白还能调节线粒体中核蛋白体大亚基的组装，影响核蛋白体的生物合成，导致氧化磷酸化水平降低，细胞内能量合成减少［16］。Oncomine是一个大型的肿瘤基因芯片分析整合数据库，为广大的科研工作者提供公开、免费的整合分析资源，数据来源为公开发表的各种高通量基因测序数据。Oncomine平台为不熟悉高通量分析的科研工作者提供了一个便捷的方式获取整合信息，只需要输入基因名称即可得到该基因在各种类型肿瘤中的mRNA表达水平差异等分析结果，并且以直观的形式输出［17］。通过对Oncomine数据库的整合分析，笔者发现hMTERF3在卵巢癌组织中显著高表达。目前研究报道，hMTERF3基因在肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌中高表达［18］，但是该基因在卵巢癌中的研究相对较少。笔者对hMTERF3基因在Oncomine数据库中表达情况分析，发现该基因在大部分肿瘤类型中均呈现高表达（表1），这一结果也证实了已有的报道。该研究还采用Western blot技术对30例卵巢癌组织及其配对的正常卵巢上皮组织中hMTERF3蛋白表达水平进行分析，检测发现28例（93.33%）卵巢癌组织中hMTERF3蛋白比正常卵巢上皮组织中呈显著的高表达（P＜0.05），使结果得到实验证实。该研究的不足之处为样本数量有限，亟待扩大样本量进一步研究。

表2 各个分期卵巢癌患者的预后与hMTERF3 mRNA水平的关系

Kaplan Meier Plotter是目前世界上被广泛接受的一个预后相关的在线分析数据库，总计涵盖了10 461例肿瘤样本，其中包括5143例乳腺癌样本、1816例卵巢癌样本、2437例肺癌样本和1065例胃癌样本，可以对54 675个基因进行相关预后分析，并得出真实可信的客观结果［19，20］。该文首次通过Kaplan-Meier Plotter数据库发现了hMTERF3基因表达水平在卵巢癌患者及不同分期卵巢癌患者中的预后价值。结果显示，卵巢癌临床分期未明时，hMTERF3表达量越高，卵巢癌的预后越差，是一个理想的预测卵巢癌预后的分子标记；在1期、1+2期及2期卵巢癌中，当截尾数据设置为PFS时，HR值均大于1。其中1+2期卵巢癌HR值为2.43，log rank P＜0.01；该期截尾数据设置为OS时，HR值1.75，log rank P=0.1698。考虑到 OS 为总生存率患者死亡原因多样（存在非肿瘤致死），且P值较小，推测hMTERF3可很好地预测早期卵巢癌患者预后；当截尾数据设置为OS时，在1期，1+2期，2期，2+3期，2+3+4期，3期，3+4期及4期卵巢癌患者中HR值均大于1，说明hMTERF3表达水平对早、中、晚期卵巢癌患者均具有很好的预后价值。

总之，该研究通过Oncomine数据库对肿瘤相关基因的信息进行深入挖掘，提出hMTERF3在卵巢癌组织中高表达；通过Western blot对卵巢癌及其配对的正常卵巢上皮组织中hMTERF3蛋白水平进行检测，实验证实hMTERF3在卵巢癌组织中高表达；进一步分析hMTERF3表达对卵巢癌患者预后的影响，发现hMTERF3高表达与卵巢癌患者的预后不良有关，将为进一步探讨hMTERF3在卵巢癌发生中的作用提供重要的理论和实验依据。此外，利用Oncomine数据库进行恶性肿瘤及其对应正常组织的基因表达差异分析，对普通科研工作者整合分析大量肿瘤基因芯片数据，寻找潜在的感兴趣的肿瘤相关基因具有参考价值。

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