牛奶中β-内酰胺高灵敏度检测试剂条研制（胶体金法）

2018-05-18宋文丹东市食品检验检测中心

食品安全导刊 2018年13期

□ 宋文丹东市食品检验检测中心

□ 何鲁江杭州诺威泰克生物技术有限公司

目前，快速检测试剂条一般采用抗原抗体反应的原理来检测目标检测物。但是由于牛奶样本中蛋白质含量较高，容易干扰检测结果，且对于灵敏度要求高，普通的抗体无法达到现场检测灵敏度的要求。胶体金法采用受体结合的原理来检测目标物，由于受体结合的亲和力是抗原抗体结合亲和力的两个数量级以上，因此在牛奶中使用受体结合的原理来制备β-内酰胺高灵敏度检测试剂条成为一个有效的手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阳性奶样、阴性奶样、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化学试剂（采购自Sigma）。镍柱（GE life）、PET-30a质粒（通用生物）、β-内酰胺BSA偶联物（购自杭州隆基生物）。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（湘仪）、摇床（湘仪）、蛋白分离柱（Bio-Rad）、分光光度计（新世纪）。

1.3 方法

1.3.1 重组β-内酰胺受体制备

查阅NCBI上β-内酰胺的序列，筛选出适合大肠杆菌表达系统的序列如下：

ACAGGCACTCGCTTTGGAACAGATTTAGCGAAGGAAGCTA AGAAGGTTCATCAAACCACCCGTACAGTTCCTGCCAAACGTGGG ACTATTTATGACCGAAATGGAGTCCCGATTGCTGAGGATGCAAC CTCCTATAATGTCTATGCGGTCATTGATGAGAACTATAAGTCAGC AACGGGTAAGATTCTTTACGTAGAAAAAACACAATTTAACAAGG TTGCAGAGGTCTTTCATAAGTATCTGGACATGGAAGAATCCTAT GTAAGAGAGCAACTCTCGCAACCTAATCTCAAGCAAGTTTCCTT TGGAGCAAAGGGAAATGGGATTACCTATGCCAATATGATGTCTA TCAAAAAAGAATTGGAAGCTGCAGAGGTCAAGGGGATTGATTT TACAACCAGTCCCAATCGTAGTTACCCAAACGGACAATTTGCTT CTAGTTTTATCGGCCTAGCTCAGCTCCATGAAAATGAAGATGGA AGCAAGAGCTTGCTGGGAACCTCTGGAATGGAGAGTTCCTTGA ACAGTATTCTTGCAGGGACAGACGGCATTATTACCTATGAAAAG GATCGTCTGGGTAATATTGTACCCGGAACAGAACAAGTTTCCCA ACGAACGATGGACGGTAAGGATGTTTATACAACCATTTCCAGCC CCCTCCAGTCCTTTATGGAAACCCAGATGGATGCTTTTCAAGAG AAGGTAAAAGGAAAGTACATGACAGCGACTTTGGTCAGTGCTAA AACAGGGGAAATTCTGGCAACAACGCAACGACCGACCTTTGAT GCAGATACAAAAGAAGGCATTACAGAGGACTTTGTTTGGCGTG ATATCCTTTACCAAAGTAACTATGAGCCAGGTTCCACTATGAAA GTGATGATGTTGGCTGCTGCTATTGATAATAATACCTTTCCAGG AGGAGAAGTCTTTAATAGTAGTGAGTTAAAAATTGCAGATGCCA CGATTCGAGATTGGGACGTTAATGAAGGATTGACTGGTGGCAG AATGATGACTTTTTCTCAAGGTTTTGCACACTCAAGTAACGTTG GGATGACCCTCCTTGAGCAAAAGATGGGAGATGCTACCTGGCT TGATTATCTTAATCGTTTTAAATTTGGTGTTCCGACCCGTTTCG GTTTGACGGATGAGTATGCTGGTCAGCTTCCTGCGGATAATATT GTCAACATTGCGCAAAGCTCATTTGGACAAGGGATTTCAGTGA CCCAGACGCAAATGATTCGTGCCTTTACAGCTATTGCTAATGAC GGTGTCATGCTGGAGCCTAAATTTATTAGTGCCATTTATGATCC AAATGATCAAACTGCTCGGAAATCTCAAAAAGAAATTGTGGGAA ATCCTGTTTCTAAAGATGCAGCTAGTCTAACTCGGACTAACATG GTTTTGGTAGGGACGGATCCGGTTTATGGAACCATGTATAACCA CAGCACAGGCAAGCCAACTGTAACTGTTCCTGGGCAAAATGTA GCCCTCAAGTCTGGTACGGCTCAGATTGCTGACGAGAAAAATG GTGGTTATCTAGTCGGGTTAACCGACTATATTTTCTCGGCTGTA TCGATGAGTCCGGCTGAAAATCCTGATTTTATCTTGTATGTGAC GGTCCAACAACCTGAACATTATTCAGGTATTCAGTTGGGAGAAT TTGCCAATCCTATCTTGGAGCGGGCTTCAGCTATGAAAGACTCT CTCAATCTTCAAACAACAGCTAAAGCTTTGGAGCAAGTAAGTCA ACAAAGTCCTTATCCTATGCCTAGTGTCAAGGATATTTCACCTG GTGATTTAGCAGAAGAATTGCGTCGCAATCTTGTACAACCCATC GTTGTGGGAACAGGAACGAAGATTAAAAACAGTTCTGCTGAAG AAGGGAAGAATCTTGCCCCGAATCAGCAAGTCCTTATCTTATCT GATAAAGCAGAGGAGGTTCCAGATATGTATGGTTGGACAAAGG AGACTGCTGAGACCCTTGCTAAGTGGCTCAATATAGAACTTGAA TTTCAAGGCTCGGGCTCTACTGTGCAGAAGCAAGATGTTCGTG CTAACACAGCTATCAAGGACATTAAAAAAATTACATTAACTTTAG GAGAC。序列长度为1677bp，经第三方序列合成公司（通用生物）合成，测序结果未发现突变。

1.3.1.1 单克隆阳性菌体制备

①将合成的质粒冻干粉使用100μL灭菌超纯水稀释。

②吸取稀释后的质粒溶液10μL，加入到100μL的感受态细胞中，冰浴30min。

③完成冰浴后，42℃金属浴热击90s后冰浴2min。

④将制备好的感受态细胞接种于1mL LB液体培养基（加入终浓度万分之一的卡纳抗生素），37℃ 、250rpm培养1h。

⑤培养后的菌体吸取200μL，涂LB固体培养基平板（卡纳抗性），37℃烘箱静止过夜。

⑥挑取菌落生长旺盛，边缘清晰的单菌落，接种于1mL LB液体培养基，37℃ 、250rpm培养过夜。

1.3.1.2 阳性单克隆蛋白表达鉴定

①吸取单克隆菌10μL,加入到10mL LB液体培养基中（2管），37℃、250rpm过夜培养。

②将10mL培养好的菌体加入到250mL LB培养基培养（37℃ 、250rpm）,每1h测试菌体浓度，当菌体吸光度超过0.6之后，加入IPTG诱导蛋白表达（4h），其中一管为对照管不进行诱导。

③将两瓶菌液分别离心10分钟，转速为8000rpm，温度设为4℃。然后弃去上清，将沉淀使用PBS稀释搅拌30min。将稀释后的菌体放入到细胞粉碎仪中粉碎15min。在12000rpm的转速下离心30min，温度控制为4℃，保留上清。

④离心后的沉淀物使用inding Buffer A(50mM Tris，8M Urea，0.5M NaCl，pH8.0）室温溶解10min后，12000rpm，4℃离心30min，取上清。

⑤将收集到的两份上清进行蛋白电泳。

图1 电泳图谱

经蛋白电泳鉴定，β-内酰胺受体蛋白主要为包涵体表达，上清表达量较低。

1.3.2 试纸的制作

1.3.2.1 重组β-内酰胺受体标记胶体金

①500mL超纯水加热至沸腾，加入终浓度为1.5/10000的氯金酸后再加入2.25/10000的柠檬酸三钠。搅拌反应10min后，水浴冷却。

②100mL制备好的胶体金溶液使用0.2M碳酸钾溶液调节PH到9.0，加入重组的β-内酰胺受体蛋白，室温搅拌30min。

③加入1mL 10%的BSA水溶液，封闭30min。

④以12000rpm的转速离心30min，弃去上清，沉淀使用金标保存液稀释（Tris：0.25%、BSA：1%）回收冷藏保存。

⑤将标记好的金标溶液，使用金标稀释液稀释到OD540吸光度为OD5(溶液中加入终浓度为2%的蔗糖和1%的海藻糖)，每个酶标孔加入稀释的金标溶液10μL,放置于45℃烘箱过夜干燥。

1.3.2.2 β-内酰胺BSA偶联物包被

①将β-内酰胺BSA偶联物使用PBS稀释到0.2mg/mL（终浓度1%蔗糖）。

②使用划膜仪将稀释好的β-内酰胺BSA偶联物包被到NC膜上，45℃烘箱过夜干燥

1.3.2.3 试纸条组装

将包被好的底板与吸水滤纸、滤膜按照正常程序组装黏贴。

1.3.3 试纸条检测

将青霉素使用阴性奶样稀释，建立梯度浓度标准品，浓度值分别为0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。该试纸条采用免疫竞争法原理，阳性为一条线，阴性为两条线。分别吸取不同浓度值的标准质控品各100μL，使用移液器反复抽打10次后将组装好的试纸条插入到酶标孔中10秒钟，5min后观察并记录相应结果。